3.1. Coleta de material biológico na seca e cheia
Nos anos de 2013 e 2014, um total de 186 amostras de músculo dorsal e 170 de fígado foram coletadas de nove espécies de peixes, na base flutuante do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) - localizado no lago Catalão, município de Iranduba, estado do Amazonas. As refridas coletas foram efetuadas ao longo de seis pontos distintos do INPA, cujas coordenadas encontram-se detacadas na Figura 2.3.
Todos os peixes foram coletados com tamanhos maiores do que os correspondentes a suas respectivas maturidades sexuais e as coletas/transporte de amostras biológicas ex situ/in situ foram autorizadas pelo IBAMA, sob os números 29837 e 39985 (Apêndice B). As nove espécies estudadas foram selecionadas dentre as que apresentam maior importância econômica para o Estado do Figura 2.3. Localização geográfica dos locais de coleta durante os períodos de cheia e seca no lago do Catalão situado no município de Iranduba, Estado do Amazonas, cerca de 20 km da capital Manaus: 1) S 03°10.570´ W 059°55.000´, 2) S 03°10.736´ W 059°54.180´, 3) S 03°09.967´ W 059°54.534´, 4) S 03°09.746´ W 059°54.488´, 5) S 03°10.030´ W 059°55.579´ e 6) S 03°10.437´ W 059°54.277´.
Amazonas, segundo levantamento realizado pelo INPA (Santos et al., 2009), e classificadas em 5 diferentes hábitos alimentares, de acordo com os critérios descritos por Santos et al., (2009) e Soares (2008):
1. Carnívoro – pescada (Plagioscion squamosissimus; Heckel, 1840);
2. Píscivoro – caparari (Pseudoplatystoma tigrinum; Agassiz, 1829), tucunaré (Cichla monoculus; Agassiz, 1831);
3. Detritívoro – curimatã (Prochilodus nigricans; Agassiz, 1829), jaraqui (Semaprochilodus insignis; Agassiz, 1829);
4. Planctívoro – mapará (Hypophthalmus edentatus; Agassiz, 1829);
5. Onívoro – tambaqui (Colossoma macropomum; Cuvier, 1816), sardinha (Triportheus elongatus; Garman, 1890), matrinxã (Brycon amazonicus; Agassiz, 1829).
Previamente aos ensaios, peixes das espécies pacu (Piaractus mesopotamicus - Holmberg, 1887) e piramutaba (Branchyplatystoma vaillantii - Valenciennes, 1840) foram obtidos no mercado local de Campinas e utilizados em estudos-piloto de desenvolvimento e padronização das metodologias experimentais (ex: extração e separação de lipídios em classes).
3.2. Extração dos lipídios
A extração de lipídios foi executada pelo método Bligh e Dyer. Os tecidos foram triturados, utilizando-se um homogeneizador (Mix Walita) para o músculo dorsal e nitrogênio líquido combinado com almofariz e pistilo para o fígado (Bligh e Dyer, 1959). Os lipídios foram isolados com uso de mistura de clorofórmio e metanol (ambos da marca/companhia LabSynth-Brasil), na proporção 2:1 (v/v), seguida de clorofórmio e água destilada. Após esse processo, obteve-se a separação da fase orgânica da fase hidrálcoolica, seguida por um processo de filtração em funil de Büchner e concentração do material orgânico em rotaevaporador. Este processo foi monitorado por cromatografia em camada delgada (TLC), segundo metodologia na qual se utiliza sílica de fase normal, como fase estacionária; hexano:éter etílico:ácido acético 80:16:4 (v/v/v), como fase móvel; e solução de ácido fosfomolíbdico etanólica 20% (v/v), como revelador (Barbosa, 2013). As amostras obtidas foram guardadas em freezer a -20°C.
3.3. Extração de lipídios polares e apolares
O fracionamento de lipídios em classes de polaridade diferentes foi realizado a partir dos lipídios isolados de músculos dorsais de peixes, segundo metodologia modificada de Johnston e colaboradores. Foram aplicados 0,5 g de lipídios em uma coluna cromatográfica com 1,4 cm de diâmetro e 7,0 cm de altura de sílica gel de fase normal (63-200 mesh). A eluição foi feita com 100 mL de clorofómio, 100 mL de acetona e 100 mL de metanol. Três frações, referentes aos lipídios neutros, glicolipídios e fosfolipídios (Johnston et al., 1989), foram coletadas. O processo foi monitorado por TLC, usando-se sílica de fase normal, como fase estacionária; clorofórmio:metanol:água 75:22:3 (v/v/v), como fase móvel; e solução aquosa de ácido sulfúrico 50% (v/v), como revelador (Barbosa, 2013). As amostras foram guardadas em freezer a -20°C.
3.4. Análises do perfil de lipídios por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
Análises qualitativas por espectroscopia de RMN de 1H, de 13C e de 31P foram realizadas no Laboratório Institucional de RMN da Unicamp, em equipamento com 600 MHz de resolução (Bruker) e com uso de sonda TBI. Aproximadamente 10 mg de lipídios foram dissolvidos em 600 µL de clorofórmio deuterado (99,8% de pureza, Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) e transferidos para tubos de RMN de 5 mm de diâmetro. As análises foram realizadas em triplicata, sob as seguintes condições: RMN de 1H - 25°C, com tempo de aquisição de 2,66 s, largura da janela espectral de 12.335 Hz, tempo de decaimento de relaxação (relaxation delay) de 2 s e com 56 números de scans; RMN de 13C - tempo de aquisição de 0,45 s, largura da janela espectral de 36.058 Hz, tempo de decaimento de relaxação (relaxation delay) de 2 s com 10.240 número de scans. Experimentos de DEPT de 135° foram obtidos à 25°C, com 3.413 número de scans. Os espectros foram processados usando Topspin e/ou MestreNova.
3.5. Quimiometria aplicada aos dados de RMN qualitativa
Os dados de RMN de 1H foram transportados em matriz de dados e analisados por PCA, utilizando-se os programas Pirouette version 3.11 (Infometrix, Bothell, WA, EUA), MetaboAnalyst e Plotly. O pré-processamento do conjunto total de dados gerados em cada espectro foi feito por autoescalamento, com o máximo de 9 fatores e excluindo-se regiões de baixo loading, com o solvente clorofórmio (7,24 ppm).
3.6. Análise de avaliação nutricional por RMN quantitativo
A quantificação de lipídios foi feita por RMN de 1H, em espectrômetro 400 MHz (Bruker) equipado com sonda BBI. Adicionou-se 100 µL de solução padrão 1,2,4,5- tetracloro-3-nitrobenzeno (concentração: 5 mg/mL, pureza: 99,86%; Sigma- Aldrich) a 10 mg de lipídios, dissolvidos em 500 µL de clorofórmio deuterado contendo TMS (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., USA). Os espectros foram adquiridos em triplicata, com uso de programa de pulso zg a 25°C, sob as seguintes condições: tempo de aquisição de 8,19 s, largura de janela de 9.995 Hz, 64 k, tempo de relaxação de 40 s (5 vezes T1) e ns 56. Os espectros foram processados usando o software TopSpin e integrados atrubuindo-se 1H para o padrão interno. Os valores absolutos das integrais foram transportados para uma planilha de Excel e a concentração de cada tipo de lipídio (Pamostra) foi calculada a partir de sua massa molecular (MM), através da aplicação da Equação 2.1.
A MM utilizada no cálculo correspondeu àquela representativa para cada classe de lipídios: (1) triacilgliceróis (4,19 ppm, MM do composto TAG (18:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/22:1(11Z))), (2) glicerofosfolipídios (3,94 ppm, MM de palmitoiloleoilfosfatidilcolina), (3) cardiolipinas (3,85 ppm, MM de tetralinoleoil cardiolipina), e (4) esterol (0,68 ppm, MM de colesterol). Os seguintes compostos também foram quantificados por RMN quantitativo: ácidos graxos totais (1,29 ppm, MM de ácido palmítico), ácidos graxos monoinsaturados (2,03 ppm, MM de ácido oleico), outros ácidos graxos poli-insaturados (exceto ácido linoleico, 2,83 ppm, MM de ácido adrenico), ácido linoleico (2,76 ppm), ácido araquidônico (1,68 ppm), EPA (0,98 ppm), e DHA (2,38 ppm).