Contrôle de la densité de fonctionnalisation

Nous disposons de quatre lots d’émulsions à quatre concentrations initiales différentes en biotine dans l’huile. Pour chaque émulsion nous avons fait varier la concentration en IgGs et nous avons mesuré la fluorescence obtenue avec le cytomètre. Comme on l’avait décrit précédemment, chaque intensité de fluorescence est convertie en un nombre de molécules d’IgGs à la surface d’une goutte.

Les courbes obtenues sont des isothermes d’opsonisation normalisées par rapport à leurs valeurs de saturation (cf. Figure 3.26). Les courbes brutes ayant des valeurs en ordonnées différentes, leur normalisation est nécessaire pour pouvoir les comparer. Elles sont décrites par la loi de Hill à 3 paramètres. Cette loi décrit le cas particulier de la fixation d’un même ligand sur plusieurs sites d’une protéine, ce qui est justement notre cas. Elle est donnée par la loi suivante :

𝜃 =   ^{L !} 𝐾_!+ 𝐿 !

où 𝜃 représente la fraction des sites comportant un ligand lié, [L] est la concentration du ligand et 𝐾_! est la constante de dissociation apparente. La constante n s'appelle la constante de Hill et décrit classiquement le degré de coopérativité de la fixation du ligand. Cette coopérativité désigne la propriété qu’ont les protéines possédant un ou plusieurs sites de fixation leur permettant de se lier à un substrat ou des ligands. La constante de Hill n augmente avec le degré de coopérativité. La liaison d’un ligand est dite à coopérativité négative quand n < 1 et indique que cette liaison diminue l’affinité de la protéine pour des liaisons ultérieures. Inversement si n >1 la liaison au ligand est dite à coopérativité positive et indique que la liaison augmente l’affinité de la protéine pour des liaisons ultérieures du ligand.

L’équation de la réaction se traduit par l’expression suivante : 𝑅 + 𝑛𝐿^𝐾⇋ 𝑅𝐿^! _!

      La constante de dissociation de cette réaction est donc:

"#$%&'()!9!+!:5.'#;0)!)'!4$($4'-(&0$'&3.!<)0!8$'-(&$1=!

! 97

!_! ! !^{! ! !}_!! ^! !

Le nombre de protéines adsorbées par rapport au nombre total de sites occupés est alors égal à: !"#$% !"#$% ! ! ! !!_! ! ! !!_! ^{! !} ! ! ! !_!! ! !

En combinant les deux dernières expressions nous obtenons un équation réduite!: !"#$% !"#$% ! ! !! ! ! ! !_! ! !

Dans notre cas, les ligands ! correspondent aux immunoglobulines avec chacunes ! sites de fixation à la biotine et les récepteurs ! correspondent à la surface des gouttes avec leurs groupements biotine: D’après ce qui précède, on peut écrire :

IgGs par goutte! ^{IgGs par goutte} Max ! ! !!"#!"#$!

!_! !

Figure 3.26. Isothermes d’opsonisation normalisées par rapport à leurs valeurs de saturation pour trois concentrations initiales en biotine. Les courbes sigmoïdales sont décrites par la loi de Hill à 3 paramètres.

La valeur de !_! correspond à la concentration en immunoglobulines nécessaire pour arriver à 50% de la saturation accessible des interfaces. La Figure 3.26 montre que les courbes de titration en fonction de la concentration en IgGs sont correctement modélisées avec une constante de Hill égale à n = 2 pour les trois conditions.

DSPE-PEO2000-biotin (mg.mL^-1) 0.015 0.03 0.05 0.15

IgGs par goutte _{Max 6.8 ± 0.4 10}³ _{5.9 ± 0.2 10}⁴ _{3.5 ± 0.05 10}⁵ _{5,5 ± 0.1 10}⁵ K_D (mol.L^-1) _{2.6 ± 0.2 10}^-8 _{3.9 ± 0.5 10}^-8 _{8.8 ± 0.5 10}^-8 _{4.4 ± 0.2 10}^-7 Table 3.4. Table de correspondance entre les conditions initiales de DSPE-PEG2000-Biotine dans l’huile et les paramètres de Hill pour les isothermes d’adsorption des immunoglobulines à la surface des gouttes.

"#$%&'()!9!+!:5.'#;0)!)'!4$($4'-(&0$'&3.!<)0!8$'-(&$1=!

! 98

sites de fixation à la biotine et en faisant l’hypothèse que la fixation d’une seconde biotine sur une immunoglobuline s’effectue très rapidement. (Weiss, 1997).

Les valeurs de saturation en immunoglobulines et celles de KD sont reportées dans le tableau Table

3.5. ci-dessus. On voit que le nombre d’IgGs par goutte varie sur deux ordres de grandeur, entre 7.10³ et 5.10⁵.

À partir de la taille moyenne ! des gouttes, nous pouvons estimer l’aire par immunoglobuline à la saturation de chaque courbe. En effet on a :

!_!"# ! ^!!!

IgGs par goutte _Max

Nous avons tracé sur la figure Figure 3.27 ci-dessous l’aire !!"# en fonction de la surface occupée par une molécule de biotine !_!"#$"%& calculée plus haut, pour quatre concentrations en lipides biotinylés (cf. Table 3.4). On voit que notre protocole de fonctionnalisation nous permet de faire varier l’aire par IgG sur deux ordres de grandeurs, entre 10⁴ nm² par IgG, jusqu’à 10² nm²/IgG.

La première valeur correspond à une densité un peu plus faible que la valeur physiologique de densité des récepteurs Fc!R présents sur la membrane de macrophages (Gandour and Walker, 1983). La seconde valeur est proche de la valeur d’une monocouche compacte d’IgGs à la surface si on considère qu’un IgG occupe une surface de 120 nm² (Werner et al., 1972).

Figure 3.27. Variation de la surface occupée par une molécule d’IgG en fonction de l’aire occupée par une biotine en surface des gouttes.

On remarque sur la figure ci-dessus que l’aire par IgG varie de manière exponentielle en fonction de l’aire par biotine. Pour des faibles densités en biotine, la valeur de saturation correspond à un IgG pour 100 biotines alors que pour les hautes densités en biotine, on compte à peu près un IgG pour une dizaine de biotines. Le procédé de fonctionnalisation par les IgGs est donc d’autant plus efficace que la densité de biotines présentes à l’interface est grande, ce qui pourrait s’expliquer par une meilleure disponibilité des biotines causée par un changement de conformation des chaînes de PEG.

Nous avons donc conçu des gouttes d’émulsions fonctionnalisées avec des densités bien contrôlées d’IgGs à leur surface. Ces densités sont mesurées de façon quantitative, mesure nécessaire à la

Chapitre  3  :  Synthèse  et  caractérisation  des  matériaux  

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compréhension du processus biologique de phagocytose en fonction de la quantité d’IgGs qui nous intéresse.