Étude de la phagocytose de billes de polystyrène fonctionnalisées

IV. Rôle de la mobilité latérale des IgGs dans le processus de

phagocytose.

Comme nous l’avons déjà souligné, la majorité des études suggèrent que la phagocytose est peu efficace pour des tailles de particules supérieures à 2 – 3 µm (Champion et al., 2008; Doshi and Mitragotri, 2010). Au delà de cette taille, les particules doivent présenter des surfaces saturées en IgGs pour induire leur internalisation (Zhang et al., 2010). Nos observations semblent montrer que des gouttes d’émulsions de grands diamètres (7 µm) sont facilement internalisées par les macrophages même pour de faibles densités d’IgGs ce qui n’est pas en accord avec ces précédentes observations. Par ailleurs d’autres études ont montré qu’une densité minimale d’IgGs en surface des objets cibles, de l’ordre de 10⁴ prot/goutte, est nécessaire pour induire la phagocytose. Cette valeur est dix fois plus grande que celle que nous avons mesurée (Gallo et al., 2010). Le phénomène de mobilité latérale des IgGs en surface des gouttes liquides pourrait donc être à l’origine de l’efficacité observée et expliquer les différences par rapport aux études précédentes. Cependant, il est nécessaire de vérifier cette hypothèse.

Pour compléter notre étude, nous avons étudié la phagocytose de billes de polystyrène de même taille fonctionnalisées avec différentes densités d’IgGs, une densité faible qui correspond à la densité minimale suffisante pour induire l’internalisation efficace des gouttes d’émulsions, une densité forte qui correspond à 10 fois plus que la densité minimale et la saturation totale de la surface des billes en IgGs.

IV.1. Étude de la phagocytose de billes de polystyrène fonctionnalisées.

Pour comparer l’efficacité de phagocytose des billes en polystyrène (PS) avec les gouttes d’émulsion, les paramètres des expériences suivants sont maintenus constants : (i) la gamme de tailles (gouttes 7 µm ; billes 6 µm), (ii) le ratio de particules par cellule (2 particules/cellule) (iii) le temps d’incubation (45 minutes). Concernant les densités d’IgGs, nous avons choisis des valeurs qui se situent dans la zone de saturation des courbes dose-réponse des gouttes présentées sur la Figure 4.13.

Comme on peut le voir sur laFigure 4.18, la densité d’IgGs dans la gamme 10⁴ - 10⁵ n’a aucune influence sur l’efficacité de l’internalisation des gouttes d’émulsions qui reste élevée. Au contraire, la densité d’opsonisation influence la phagocytose des billes de PS puisque à une densité 5 fois plus faible que la saturation de l’interface, l’efficacité d’internalisation diminue d’un facteur trois.

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131 Figure 4.18. Comparaison de l’effet de la densité d’IgGs en surface sur l’efficacité de l’internalisation des gouttes en (a) et des billes en PS en (b). *** indique p < 0,001.

Pour de faibles densités d'IgGs, la différence dans l'efficacité de l'internalisation des gouttes vs. billes pourrait être une conséquence de la différence en termes de propriétés mécaniques des cibles comme leur déformabilité.

En effet, il a été démontré que dans le cas des billes de polyacrylamide fabriquées avec différents degrés de réticulation, les particules rigides qui en résultent sont plus efficacement internalisées que celles qui sont déformables (Beningo and Wang, 2002). Nos expériences ne suivent pas cette tendance. En effet, aux faibles densités d’IgGs, les billes rigides en polystyrène sont faiblement internalisées, tandis qu’aux plus fortes densités leur internalisation est similaire à celle des gouttes qui sont déformables. Ce paramètre ne permet donc pas d'expliquer la différence entre l'efficacité d'internalisation de billes et de gouttes opsonisées avec de faibles densités d’IgGs.

Figure 4.19. Nombre des cellules qui internalisent en %, incubées avec des billes de polystyrène ou des gouttes opsonisées avec la même quantité d'IgGs (3.10⁴ IgGs/particule, après 45 min d'incubation).!*** indique p < 0,001.

Afin de déterminer s’il y a une perte de fonctionnalité par adsorption directe des IgGs sur les billes une mauvaise orientation des fragments Fc à la surface des billes, nous les avons fonctionnalisées différemment. La première étape consiste à faire adsorber à saturation de la BSA biotinylée, qui donne accès aux biotines en surface. Ensuite, en deuxième étape, nous ajoutons les IgGs anti-biotines

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132 fluorescentes. Nous avons par la suite comparé l’efficacité de la phagocytose des billes ainsi fonctionnalisées avec des gouttes d’émulsions ayant la même densité d’IgGs en surface, de l’ordre de 3.10⁴ prot/goutte.

La Figure 4.19 montre que même avec a priori une meilleure orientation des IgGs en surface des billes, celles-ci sont très faiblement internalisées comparées aux gouttes. La faible internalisation des billes n’est donc pas due à une mauvaise orientation des IgGs en surface. Zhang et al. ont précédemment démontré que des billes de polystyrène fonctionnalisées avec de faibles quantités d’IgGs étaient faiblement internalisées, ce qui en accord avec les résultats que nous obtenons (Zhang et al., 2010). Ceci montre que la densité d’IgGs en surface des particules influence le processus de phagocytose.

Figure 4.20. Superposition d’images en transmission et en épifluorescence de l'internalisation des gouttes et des billes de polystyrène à deux densités différentes d'IgGs par particule. Échelle : 10 "m.

En observant les détails de l’internalisation des particules par microscopie de fluorescence, la Figure 4.20 montre que les IgGs à la surface des gouttes et des billes ont un comportement très différent quand les objets sont au contact des gouttes.

On observe des clusters d’IgGs uniquement pour les gouttes d’émulsions fonctionnalisées avec de faibles densités d’IgGs. Dans les conditions où l’on travaille avec de fortes densités, la surface des gouttes est presque saturée en IgGs ce qui rend les variations locales de la répartition des opsonines à peine observables et explique pourquoi aucun cluster n’est visible.

Les billes de polystyrène, quant à elles, présentent à leurs surfaces des IgGs incapables de diffuser quelque soit leur densité. Ceci suggère que les différences de propriétés interfaciales des deux types de particules pourraient influencer fortement la réponse phagocytaire.

Chapitre  4  :  Phagocytose  de  gouttes  d’émulsions  fonctionnalisées  

133 Il semble donc qu’il y ait un seuil à franchir pour activer les mécanismes d’internalisation via les complexes IgGs-FcγR. La mobilité latérale des IgGs dans la zone de contact avec le phagocyte peut augmenter la densité locale dans cette région et aider à franchir ce seuil pour déclencher la phagocytose.