3- Material e Métodos
3.1- Pacientes
No período de abril de 2003 a março de 2004 foram recrutados 45 pacientes para implante eletivo de stent coronariano no estudo intitulado “Estudo
Prospectivo, Randomizado, Aberto Para Avaliar a Eficácia e Segurança de Sirolimus Oral em Inibir a Proliferação da Neoíntima Após Implante de Stent Coronariano” que foi registrado sobre o CEP: 0882/02. Trinta e nove destes pacientes foram selecionados para o estudo da função vasomotriz dependente do endotélio, que foi avaliada com administração intracoronariana de doses crescentes de acetilcolina e da função vasomotriz independente do endotélio, que foi avaliada pela administração intracoronariana de nitroglicerina. Essas avaliações foram feitas em dois momentos, a saber: quatro horas após o implante do stent e no seguimento de oito meses. (Apêndice 1 e 2: Algoritmo do Protocolo e Algoritmo da Avaliação da Função Vasomotriz Dependente e Independente do Endotélio). Todos os pacientes foram submetidos à ultrassonografia intracoronariana (USIC) nos dois momentos. Os pacientes foram randomizados para três grupos distintos:
- Grupo 1: Os pacientes receberam dose de ataque de Sirolimus, via oral (VO), de 15 mg, seguida de 6 mg VO por dia mantida por um mês, com concentração sanguínea alvo de10-20 ng/ml.
- Grupo 2: Os pacientes receberam dose de ataque de Sirolimus, via oral, de 6 mg, seguida de 2 mg VO por dia mantida por um mês, com o concentração sanguínea alvo de.5-10 ng/ml.
- Grupo 3: Os pacientes não foram tratados com Sirolimus.
Os pacientes do grupo 1 e 2 receberam o Sirolimus na véspera da angioplastia. Neste estudo, de avaliação da eficácia e segurança da droga em prevenir a reestenose intrastent, foram selecionados e randomizados 45 pacientes, sendo 15 em cada grupo. A amostra para análise da função vasomotriz seguiu os critérios abaixo:
3.2 - Critérios de inclusão:
- Doença arterial coronariana sintomática ou com isquemia miocárdica demonstrada;
- Artéria coronária com diâmetro de referência maior que 2,5 mm;
- Implante de stent com sucesso (lesão residual inferior a 20%, fluxo TIMI III, sem evidência angiográfica ou à ultrassonografia de trombo ou dissecção);
- Assinatura do consentimento livre e informado.
3.3 - Critérios de exclusão:
- Impossibilidade médica de suspender nitrato de longa duração e ou bloqueadores de canal de cálcio nas 48 horas precedentes à angioplastia e estudo da função vasomotriz;
- Angina após implante do stent;
- Espasmo coronariano seguido ao implante do stent; - Hipertensão arterial não controlada;
- Bloqueio atrioventricular de segundo e terceiro graus; - Estenose aórtica grave;
- Gestantes;
- Doença pulmonar obstrutiva crônica;
- Insuficiência renal aguda ou crônica (creatinina maior que 1,5 mg%); - Insuficiência cardíaca tipo funcional III e IV;
- Doença infecciosa aguda ou crônica;
- Tronco de artéria coronária esquerda menor que 10 milímetros para evitar infusão intracoronariana seletiva em um dos ramos principais
Com estes critérios, recrutamos 39 dos 45 pacientes randomizados. Dois pacientes foram excluídos por apresentarem tronco da artéria coronária esquerda curto, três apresentaram espasmo coronariano após stent e um paciente foi submetido a cirurgia de revascularização depois da randomização por opção do médico assistente.
3.4- Protocolo clínico e técnica do cateterismo cardíaco
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo - SP, CEP 0887/04 e foi realizado no Serviço de Hemodinâmica e Cardiologia Intervencionista do Hospital São Paulo – SPDM e Hospital do Rim e Hipertensão – Fundação Osvaldo Ramos.
As técnicas de angioplastia com implante de stent e de ultrassonografia seguiram a prática médica padrão. Depois de quatro horas da angioplastia, os pacientes foram submetidos à primeira fase de avaliação da função vasomotriz (fase basal). Neste momento, o introdutor arterial era trocado por outro de igual diâmetro para reduzir o risco de contaminação. A projeção que melhor mostrasse os 15 milímetros distais ao stent, definidos arbitrariamente como segmento alvo de estudo, foi selecionada.
Com objetivo de obter melhor qualidade angiográfica, maior reprodutibilidade e minimizar as variações de magnificação radiológica, todos os dados de projeção, altura da mesa e do intensificador de imagem foram anotados e repetidos a cada série de angiografias, bem como aos oito meses, quando os pacientes foram submetidos à nova avaliação da função endotelial.
Os estudos foram realizados em sistema de raios X H5000, Digital
Cardiac Imaging (Philips, Erlhanger, The Netherlands), quando realizados no
Hospital do Rim e Hipertensão e no sistema de raios X Infinix Toshiba (Shibaura 1- chome, Minato-ku, Tokyo 105-8001, Japan), quando realizados no Hospital São
Paulo.
As angiografias foram realizadas com injeção de 14 ml contraste na artéria coronária esquerda e 9 ml na artéria coronária direita, na velocidade de 4 ml/s com pressão máxima 400 PSI, utilizando uma bomba injetora eletrônica ANGIOMAT 6000. As angiografias foram realizadas em apneia neutra, inspiratória ou expiratória conforme conveniência de critério angiográfico. Utilizamos o contraste não iônico de baixa osmolaridade e teor de iodo de 350 mg/ml para o Henetix - 350™ (Guerbet
Laboratorie Française). A angiografia foi realizada com lente de sete polegadas e
velocidade de filmagem de 30 quadros por segundo.
Os pacientes foram mantidos em hidratação venosa de 1,5 ml/kg de peso de solução salina por pelos menos seis horas após os procedimentos.
3.5- Avaliação da função endotelial
Durante a infusão de acetilcolina intracoronariana, monitoramos a frequência cardíaca, a pressão arterial, o eletrocardiograma e a oximetria digital continuamente. As infusões de acetilcolina foram feitas na velocidade de 1,25 ml/min e 0,625 ml/min para a artéria coronária esquerda e direita, respectivamente. A solução de acetilcolina foi infundida durante dois minutos com bomba infusão de seringa modelo IP 680 (Samtronic do Brasil, LTDA). As doses foram idênticas tanto na fase basal como no seguimento de oito meses.
A solução de acetilcolina foi sempre preparada pelo investigador principal, dissolvendo-se o pó da substância estéril em solução salina 0,9% até a concentração X-y mol/L desejada. A solução de acetilcolina foi então diluída novamente em soro fisiológico imediatamente antes do estudo. As infusões intracoronarianas foram feitas na sequência abaixo, conforme os algoritmos do protocolo e de avaliação da função vasomotriz (Anexos 1 e 2, respectivamente):
1. Controle: solução salina 0,9%
2. Acetilcolina 10-6 mol/L (0,036
µg
/ml) 3. Acetilcolina 10-5 mol/L (0,36µg
/ml) 4. Acetilcolina 10-4 mol/L (3,6µg
/ml) 5. Re-controle: solução salina 0,9% 6. Nitroglicerina 300µg
Na fase basal, o estudo da função endotelial ocorreu entre quatro a cinco horas após a última dose de nitroglicerina intracoronariana utilizada durante o implante do stent com finalidade de eliminar os efeitos da nitroglicerina na função endotelial (112). No seguimento de oito meses, começamos o procedimento pelo estudo da função endotelial e em seguida foi feita a administração intracoronariana de nitroglicerina e a ultrassonografia intracoronariana (USIC).
Presumindo um fluxo coronariano de 125 ml/min e de 65 ml/min (113) para a artéria coronária esquerda e direita, respectivamente, concentrações a jusante de acetilcolina de 10-8, 10-7, 10-6 mol/L devem ter sido alcançadas.
Devido à meia-vida curta da acetilcolina, as angiografias foram feitas até 10 segundos após o término de cada infusão. Cada infusão foi separada uma da outra por um período mínimo de recuperação de três minutos.
Os diâmetros dos segmentos coronarianos foram medidos on-line por análise coronariana quantitativa. Durante a infusão da acetilcolina, caso a luz da artéria coronária em qualquer segmento reduzisse para mais de 75%, ou se o paciente queixasse de angina, ou ainda bradicardia grave ocorresse, esta infusão seria interrompida e o protocolo terminado.
Considerando o demonstrado por Hill et al. (114) nenhuma modificação significante causada pelo contraste iodado foi presumida.
3.6 - Angiografia coronariana quantitativa
As medidas dos diâmetros dos segmentos coronarianos expressas neste estudo foram aqueles obtida off-line usando a gravação das imagens arquivadas em
Compact Disc com formato DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine), no sistema de angiografia coronariana quantitativa Cardiovascular Measurement System (CMS) versão 5.0 (Medis, Neunen, The Netherlands).
Um quadro do fim da diástole final de cada angiografia foi selecionado pelo investigador para análise quantitativa. Todas as análises foram executadas pelo investigador principal deste projeto (RWAF).
O segmento alvo (SA) de estudo foram os 15 milímetros distais, imediatamente à borda distal do stent.
O Cardiovascular Measurement System (CMS) versão 5.0 é um sistema de análise coronariana quantitativa que emprega um algoritmo de detecção automática da borda da luz vascular e com isso define as várias medidas de interesse de cada segmento. Estas medidas são o comprimento do segmento, o diâmetro mínimo da luz, o diâmetro médio e o diâmetro de referência. O diâmetro é determinado por integração de diâmetros sucessivos através de todo segmento. Para este estudo julgamos que a variação do diâmetro médio do segmento alvo de estudo é a variável que melhor expressa as propriedades vasomotrizes dependentes do endotélio (resposta à acetilcolina) e independentes do endotélio (resposta à nitroglicerina).
3.7- Análise da ultrassonografia intracoronariana
A ultrassonografia intracoronariana foi realizada logo após o implante do stent e depois da análise da função endotelial aos oito meses. As imagens e medidas ultrassonográficas foram realizadas de acordo o padrão recomendado pelo
American College of Cardiology e European Society of Cardiology.(115). As imagens
ultrassonográficas coronárias foram processadas através de sistema mecânico (Galaxy II, Boston Scientifc Corp). O transdutor, posicionado a pelo menos 15 mm distal ao stent, foi recuado automaticamente na velocidade constante de 0,5 mm/sec. Apenas as imagens obtidas sem artefatos foram consideradas para análise. Foram utilizados cateteres Atlantis SR Pro 40 MHZ ou Ultra Cross 30 MHZ (Atlantis,
Boston Scientific Scimed, Inc, Maple Grove, Minn). Para corrigir as variações de
medidas entre os cateteres utilizados foram aplicadas equações de calibração (116). As imagens foram gravadas em Compact Disc (CD) e analisadas off-line através do software apropriado (QIVA, Pie Medical BV, The Netherlands) para medidas das áreas de secção transversal e dos volumes derivados.
Os segmentos arteriais foram cortados seriadamente a cada 0,5 mm. Após oito meses o mesmo procedimento foi repetido, sendo utilizado marcadores angiográficos para análise dos mesmos cortes tomográficos. Para cada secção transversal foram planimetradas manualmente as áreas do vaso (AV) e do lúmen (AL), através dos contornos da lâmina elástica externa e do lúmen arterial respectivamente. A área da placa aterosclerótica (AP), expressa em milímetros foi obtida a partir da AV subtraída da AL (AP=AV-AL). Uma vez que foram realizados cortes com intervalos de 0,5 mm, o volume da placa (VP) expresso em mm3, pode
ser calculado utilizando-se a regra de Simpson, bastando multiplicar AP media pela extensão da placa em “mm”. O VP foi normalizado pela extensão do segmento com placa para obtenção do VP em mm3/mm. O volume de placa percentual foi calculado
como:
Todos os dados foram avaliados pelo investigador principal e revisados por dois outros observadores sem conhecimento dos grupos para os quais os pacientes foram randomizados.
APx 100 AV
3.8- Análise estatística
A amostra foi calculada para o trabalho intitulado: “Estudo Prospectivo, Randomizado, Aberto Para Avaliar a Eficácia e Segurança de Sirolimus Oral em Inibir a Proliferação da Neointimal Após Implante de Stent Coronariano”. O tamanho da amostra deste estudo foi projetado para investigar a eficácia da administração oral de Sirolimus para redução do volume de neointimal após implante de stent coronário. O cálculo do tamanho da amostra baseou-se em dados dos grupos placebo de estudos prévios, que tinham como objetivo primário a redução do volume neointimal utilizando a administração local ou sistêmica de diferentes fármacos (117- 121).
Nesses estudos, o volume neointimal (normalizado para o volume do stent) representou 30 + 15% do volume dos stents, quando avaliado por ultrassonografia intracoronariana, 4 a 12 meses após a revascularização percutânea. Dessa forma, admitindo-se que a administração sistêmica de Sirolimus reduz em 40% o volume de neointimal intrastent e considerando-se a probabilidade de erro tipo 1 de 5% (=0,05) e poder do teste de 80% (=0,2), um número total de 42 pacientes (14 por grupo) seriam necessários para demonstrar a eficácia de cada uma das estratégias terapêuticas. Pela possibilidade de eventual óbito, situação clínica que impeça um dos dois reestudos ou perda de seguimento por qualquer motivo, foram recrutados 15 pacientes por grupo. O estudo da função vasomotriz utilizou esta amostra de conveniência.
As variáveis contínuas são expressas em valores médio ± desvio padrão. Para estudar o comportamento das variáveis numéricas segundo grupo ao longo do tempo, considerando-se a associação entre as medidas obtidas em um mesmo indivíduo, empregou-se o modelo de análise de variância com medidas repetidas. Para associação entre as variáveis contínuas foram realizados gráficos de dispersão e correlação linear de Pearson.
As variáveis categóricas são expressas em valores percentuais e associação entre as variáveis de interesse foi feita através do teste exato de Fischer. O estudo de associação entre a ocorrência de disfunção endotelial e as demais variáveis de interesse foi realizado com o uso do teste exato de Fisher. Um valor de nível descritivo menor que 0,05 foi considerado significante. Também foram
aplicados testes para variáveis não paramétricas cujo os resultados foram os mesmos.