Conséquences cellulaire des DSB induites par la CPT

Après formation d’une DSB induite par la CPT, des mécanismes de réponse aux dommage à l’ADN (DDR = DNA Damage Response) incluant les voies de réparation de l’ADN, l’arrêt du cycle cellulaire et/ou l’apoptose sont activés (Jackson and Bartek, 2009).

II.4.5.1 Activation de la DDR en réponse aux DSB induites par la CPT

Les protéines senseurs ATR (ATM Rad3-Related Protein), ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) et DNA-PK (DNA-dependent Protein Kinase) sont recrutées au niveau de la DSB induite par la CPT et initient la DDR avec notamment les phosphorylations de H2AX en

73 sérine 139 (nommée γH2AX), de RPA (Replication protein A) et de p53 (Pommier, 2006). ATM et ATR transduisent le signal du dommage en activant leur substrats respectifs Chk1 et Chk2. Bien que Chk1 et Chk2 soient rapidement induites pas de faibles doses de CPT, il semblerait que la voie ATR/Chk1 soit majoritairement activée en réponse aux Rep-DSBs (Furuta et al., 2003). Au contraire, les TC-DSB induites par la CPT sont dépendantes de l’activation d’ATM et indépendantes d’ATR (Huang et al., 2010; Lin et al., 2008; Sakasai et al., 2010; Sordet et al., 2009). Des altérations dans l’expression de ces protéines sensibilisent les cellules cancéreuses à la CPT (Pommier, 2006).

II.4.5.2 Réparation des DSB induites par la CPT

Les DSB sont réparées majoritairement par recombinaison homologue (HR) ou par jonction d'extrémités non homologues (c-NHEJ). Lors de la collision entre un Top1cc bloqué par la CPT et la fourche de réplication, le mécanisme de « replication run-off » génère une DSB à l’extrémité de la fourche de réplication. Cette DSB, nommée « double strand-end » (DSE), est préférentiellement réparée par HR en phase S (Adachi et al., 2004; Pommier, 2006). Les mutations inhibitrices de gènes impliqués dans la HR tels que RAD51, RAD52, RAD54, BRCA2 ou encore XRCC2 confèrent aux cellules une hypersensibilité à la CPT (Ambrosini et al., 2008; Hinz et al., 2003; Maede et al., 2014; Marple et al., 2006; Nitiss and Wang, 1988; Rahden-Staron et al., 2003). Le rôle que joue c-NHEJ dans la réparation des DSB induites par la CPT n’est pas clairement défini. En effet, les cellules déficientes en DNA-PK, Ku70, Artemis ou XRCC4 sont plus sensibles à la CPT ou au topotécan (Darroudi et al., 2007; Katsube et al., 2011; Shao et al., 1999; Tian et al., 2007). D’autres études montrent, au contraire, qu’une inhibition de DNA-PK, Ku70 ou de la ligase IV induit une résistance des cellules en réponse à la CPT (Adachi et al., 2004; Maede et al., 2014; Otsuki et al., 2007)

II.4.5.3 Apoptose induite par la CPT

La CPT induit l’activation des voies classiques de l’apoptose. La voie principale impliquée dans l’activation de l’apoptose induite par la CPT est la voie intrinsèque correspondant à la libération de molécules pro-apoptotiques par la mitochondrie (Figure 31) (Sordet et al., 2003). La CPT augmente la perméabilité de la membrane externe de la mitochondrie (Solary et al., 2000; Solary et al., 2001). Ce processus est régulé par les protéines de la famille Bcl-2 (Delbridge et al., 2016; Gross et al., 1999). Cette famille inclue

74 des protéines qui sont soit anti-apoptotiques, tels que Bcl-2 et Bcl-xL, ou pro-apoptotiques, comme entre autres Bax et Bak. La perméabilisation de la membrane externe de la mitochondrie entraîne la libération de molécules pro-apoptotiques dans le cytosol. Parmi ces protéines, AIF (apoptosis inducing factor) et l’endonucléase G induisent directement l’apoptose par condensation de la chromatine et fragmentation de l’ADN. D’autres molécules, incluant le cytochrome c, Smac-Diablo et Htra2-Omi, activent les caspases (Tait and Green, 2010). Le cytochrome c interagit avec la protéine Apaf-1, en présence d’ATP, ce qui permet le recrutement de la procaspase-9 dans un complexe appelé « apoptosome » (Saleh et al., 1999; Srinivasula et al., 1998). La formation de ce complexe entraîne l’autoactivation et l’activation de la caspase-9 mature, qui à son tour active d’autres caspases 9 ainsi que les caspases-3 et 7. Par la suite, la caspase-3 active d’autres caspases en aval au sein d'une cascade protéolytique (Slee et al., 1999). Simultanément avec le cytochrome c, Smac-Diablo et Htra2-Omi sont libérés afin de neutraliser l’effet inhibiteur des protéines IAPs (Inhibitors of Apoptosis Proteins) sur les caspases-3, 7 et 9 (Vaux and Silke, 2003).

Dans certaines cellules, la CPT active la voie extrinsèque de l’apoptose impliquant le récepteur de mort Fas (appelé aussi APO-1 et CD95) (Figure 31). La liaison de Fas avec son ligand naturel FasL induit le recrutement de la protéine adaptatrice FADD (Fas-Associated protein with Death Domain) qui permet à son tour le recrutement de la procaspase-8, afin de former le DISC (Death-Inducing Signaling Complex) (Chinnaiyan et al., 1995; Medema et al., 1997). Au sein de ce complexe, la caspase-8 s’autoactive et induit l’apoptose en clivant directement les caspases effectrices 3 et 7 ou indirectement via la voie mitochondriale (Scaffidi et al., 1998). La CPT augmente l’expression de Fas et FasL (Chatterjee et al., 2001; Shao et al., 2001). Cependant, l’implication de la voie extrinsèque dans ce mécanisme semble être minoritaire puisque l’inhibition de l’interaction entre FasL et Fas ne supprime pas l’apoptose induite par la CPT (Shao et al., 2001).

L’apoptose induite par la CPT met en jeu certains mécanismes dépendant de la protéine p53. p53 est impliquée dans de nombreux processus apoptotiques. Par exemple, p53 peut agir en tant que facteur de transcription des protéines pro-apoptiques de la famille Bcl-2 (Bax, Bid) ou directement au niveau de la mitochondrie dans un mécanisme indépendant de la transcription (Chipuk and Green, 2006; Mihara et al., 2003). Malgré l’implication de p53 dans les processus d’apoptose, la CPT induit l’apoptose dans les cellules leucémiques HL60 déficientes en p53 (Shimizu and Pommier, 1997; Solary et al., 1994). Ainsi, la CPT est

75 capable d’induire l’apoptose indépendamment de p53, notamment via le récepteur nucléaire Nur77 (Lin et al., 2004) et la kinase checkpoint Rad9 qui ciblent directement la mitochondrie (Komatsu et al., 2000).

Figure 31 : Schéma des voies apoptotiques activées par la CPT. La CPT active principalement la voie intrinsèque (ou voie

mitochondriale) de l’apoptose. Cette voie implique la libération par la mitochondrie de molécules pro-apoptotiques (AIF, cytochrome c, Smac-Diablo) aboutissant à l’activation de caspases effectrices (3 et 7) ou à la fragmentation de la chromatine. La perméabilisation de la membrane mitochondriale est régulée par les protéines de la famille Bcl-2 (pro-apoptotiques : Bax/Bak, anti-apoptotiques : Bcl-2/Bcl-xL). La voie extrinsèque est minoritaire dans l’induction de l’apoptose par la CPT. L'activation du récepteur de mort Fas par son ligand FasL induit le recrutement du complexe DISC composé de la molécule adaptatrice FADD et de la procaspase-8. L’autoclivage de la caspase 8 permet d’activer la voie mitochondriale via la protéine Bid ou d’activer les caspases effectrices (3 et 7) (Sordet and Solier, 2012).

76