CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

La construction des phages T6g38amGRM1, T6g38amGRM2, T6g38amGRM3, T6g38amGRM4 et T6g38amGRM5 a été entreprise. Les phages T6g38amGRM3 et T6g38amGRM5 sont les deux phages ambre qui ont pu être isolés. Les phages ambre T6g38amGRM1, T6g38amGRM2 et T6g38amGRM4 n’ont pu être isolé par la technique des répliques sur les souches su+ et su-. La fréquence de recombinaison, entre un gène présent sur un plasmide et un gène présent sur un génome, est généralement inférieure à 1%. Il est donc possible que dans le cas des phages T6g38amGRM1, T6g38amGRM2 et T6g38amGRM4, cette fréquence soit plus faible (1/1000). Ainsi le nombre de plages testées (environ 150) n’est certainement pas suffisant pour que la probabilité d’isoler une plage de phages ambre soit élevée. Les phages T6g38amGRM3 et T6g38amGRM5 ont ensuite été caractérisés pour confirmer qu’ils remplissaient les critères des phages ambres, et qu’ils étaient utilisables en tant que crible afin de faciliter l’isolement de différents phages recombinants lors de l’étude de l’adhésine gp38 du phage T6. Cette caractérisation a mis en évidence que la région de la gp38 comprenant GRM3 à Cfin est en partie ou totalement impliqué dans la fonction de l’adhésine. Cependant nous avons aussi vu qu’une région plus petite que celle contenant la région du GRM5 à Cfin est aussi indispensable. Il est donc évident qu’au moins une partie de la région GRM5-Cfin soit responsable de la fonctionnalité de l’adhésine. Une autre évidence observée lors de la caractérisation de ces phages ambre est que l’adhésine gp38 ne tolère pas de changement important sur certaines positions, en particulier la position 173. Cette intolérance au changement d’acide aminé sur certaines positions pourrait aussi expliquer l’échec d’obtention des phages T6g38amGRM1, T6g38amGRM2 et T6g38amGRM4. La nature des acides aminés en position 115, 145, 173 et 212 qui se trouvent respectivement juste en amont des GRM1, GRM2, GRM3 et GRM4 seraient donc importante. Il est possible que

ces acides aminés, se trouvent dans des positions clefs, permettant le maintient d’une conformation optimal pour la fonction de l’adhésine.

Des travaux de structure cristallographique effectués, chez le phage T4, sur la gp12 (Fibres caudale courte responsable de l’adsorption irréversible :Thomassen et al., 2003) et l’extrémité de la gp37 ( contenant la région responsable de la fonction d’adhésine de type T4 : Bartual et al. 2010) ont permis d’observer des sites de liaison à des ions métalliques (zinc pour gp12 et fer pour gp37) au niveau de motifs Histidines appelé « His-Box » présents sur ces deux protéines. La gp12 et gp37 étant homotrimériques, les liaisons covalentes avec les ions métalliques sont coordonnées par plusieurs histidines présentes sur les trois chaines protéiques. Ainsi ces liaisons covalentes pourraient augmenter la stabilité de la structure tertiaire. Il est possible que de façon similaire sur l’adhésine de type T6, certains acides aminés présent dans les GRMs ou à proximité (par exemple W115, N145, G173 et G212) soient responsable de la fixation d’ion métallique. Ces ions métalliques permettraient aussi de stabiliser la structure pour une reconnaissance optimale des récepteurs bactériens. Bien qu’on ne sache toujours pas si la gp38 est homotrimérique, on peut supposer que les ions métalliques soient coordonnés par des acides aminés présents dans différents GRM, sur des chaines différentes (comme pour la gp12 et gp37) ou encore sur la même chaine.

Des travaux de mutagénèses plus approfondies au niveau de certaines positions pourraient révéler des implications dans le maintien de la structure. Par exemple, il serait intéressant de reproduire les constructions des phages, T6g38amGRM1, T6g38amGRM2 et T6g38amGRM4, avec des souches su+ différentes de CR63, qui auront la propriété de remplacer le codon stop par un acide aminé autre que la Sérine. L’obtention de ces phages offriront la possibilité de construire d’autres phages recombinants afin d’affiner l’analyse de l’adhésine. Par ailleurs l’obtention d’une structure cristallographique permettrait de vérifier l’éventuelle présence d’ion métallique et les acides aminés qui coordonnent cette liaison.

1.2. PUBLICATION I THE gp38 ADHESINS OF THE T4 SUPERFAMILY: A COMPLEX MODULAR DETERMINANT OF THE PHAGE’S HOST SPECIFICITY

Genome Biology and Evolution, Accepté le 7 juin 2011.

Abbreviations: am, amber mutant;

∆, deletion mutant;

DHF, Distal Half Fiber; HPR, Hyperplastic Region; HVS, Hyper-Variable Segment; g, gene; gp, gene product; GRM, Glycine-Rich Motif; LPS, Lipopolysaccharide; LTF, Long Tail Fiber; PHF, Proximal Half Fiber; STF, Short Tail Fiber.

1.2.1. INTRODUCTION

Viruses infecting prokaryotic organisms have an enormous impact on our biosphere. This vast and diverse population of nano-predators is a major determinant of the planet’s microbial ecology (Wommack and Colwell 2000, Suttle 2005). Such viruses also play an important role in evolution by mediating much of the horizontal gene transfer among prokaryotes (Comeau and Krisch 2005). Eubacterial and Archaeal viruses are enormously diverse and hence only an infinitesimal fraction of the different morphological types have been studied in any detail. Among these are the well-known virulent T-even phages (T2, T4, T6, etc.) that infect Escherichia coli. Recently, it has become evident that these classical phages belong to a vast virus superfamily whose members are ubiquitous in the environment (Desplats and Krisch 2003, Filée et al. 2005, Comeau and Krisch 2008, Comeau et al. 2010). These T4-like phages all share a common basic virion morphology based on an elongated icosahedral head that packages a 160-260 kb genome (Ackermann and Krisch 1997). The phage head attaches via one of its 20 vertices to a long complex contractile tail structure that is terminated by a hexagonal base-plate with two sets of six retractable tail fibers (Leimann et al. 2003). The long tail fibers (LTF) reversibly anchor the virion to specific sites on the surface of bacteria via an adhesin located at the tip of the LTF (Riede et al. 1987). The recognition specificity of these adhesins largely defines the phage’s host range. The binding of the phage’s six LTFs to the receptors on the bacterial surface distorts the structure of the base-plate causing it to release the retracted short tail fibers (STF). This allows the STFs to bind irreversibly to a second set of bacterial receptors and triggers the injection of the phage genome (Rossmann et al. 2004). Immediately thereafter, the expression of the phage early genes shuts off all host- specific synthesis and initiates phage DNA replication. Subsequently, the infection produces the virion structural components and a complex morphogenetic pathway assembles them into the progeny phage. Finally, the lysis of the infected cell liberates the matured virions (see Karam et al. 1994).

Although the tail fiber adhesin is responsible for much of the T-even phage’s adsorption specificity, this protein’s structure and function has not been studied in depth. Such knowledge is of considerable interest for both applied and fundamental research. As an obvious example, the treatment of bacterial infections by therapeutic phages would be more effective if a phage’s host range could be easily manipulated. Similarly, for fundamental

research, the features of the adhesin that permit this protein to recognize a variety of different targets, but yet allow it to easily change its recognition specificity are intrinsically interesting scientifically and also potentially exploitable in nanotechnology applications. The T-even adhesins are encoded by genes that have a curious mixture of conserved and hyperplastic sequences and recombinational shuffling of these sequences can give rise to chimeric adhesins with novel combinations of recognition specificities. Interestingly, the genetic exchanges that do this often occurred within or near the highly conserved motifs in the otherwise plastic segments of the adhesins (Tétart et al. 1996 and 1998). This suggests that the adhesins may have evolved a way to generate diversity selectively within their recognition specificity domains that is an intriguingly simple and effective evolutionary strategy for any protein with an adhesin-like function.

Here, we report on the intricately modular design of the gp38 adhesin. As will be seen, such a modular structure allows the adhesin to resolve its apparently conflicting design constraints, permitting it to recognize bacterial receptors with high specificity that can, nonetheless, be changed easily.