Chapitre 5 : Conclusions et perspectives
L’objectif de ce travail a été le développement d’inhibiteurs de DOT1L, une HMT impliquée dans l’expression des oncogènes liés à la leucémie de type MLLr.
Il a été démontré que l’inhibition de DOT1L conduit à l’hypométhylation de ces gènes, permettant de les réprimer. Les inhibiteurs de DOT1L (DOT1Li) stoppent ainsi la prolifération spécifiquement des cellules leucémiques MLL-r, tout en arrêtant le cycle cellulaire, et conduisant à la différenciation et à l’apoptose.[9,10,28]
Nous avons donc conçu une structure générale reprenant le motif aminopyrimidine du composé SGI-1027 (19), inhibiteur de DNMT, qui mimerait le rôle des motifs (déaz)adénosine des inhibiteurs de DOT1L nucléosidiques EPZ004777 (43) et EPZ-5676 (45) (figure 5.1). Ces composés présentent une activité très élévée et une spécificité sur DOT1L, malgré leur mauvais profil chimique et
pharmacocinétique. Nous avons envisagé de remplacer le ribose de ces composés de référence par
différents groupements aryles.Figure 5.1. Conception des inhibiteurs potentiels de DOT1L
Des modulations ont été réalisées autour de ce pharmacophore et nous avons développé différentes voies de synthèse pour les obtenir. Les composés synthétisés peuvent être classés en 5 séries différentes (figure 5.2).
Les premiers résultats de leur activité sur DOT1L ainsi que l’étude de modélisation moléculaire sur la structure résolue du co-cristal DOT1L-EPZ-004777 (43) (PDB : 4ER5) ont permis de guider notre étude de rélations structure-activité.
Les composés benzéniques ALIPF197, ALIPF199 et ALIPF200, et thiophéniques ALIPF281, ALIPF282 et ALIPF291 ont montré un pourcentage d’inhibition supérieur à 50 % (à une concentration de 32 µM) sur DOT1L (figure 5.3).
Figure 5.3. Composés possédant une inhibition de DOT1L supérieure à 50 % à une concentration de 32 µM Ces premiers résultats nous ont permis d’identifier des motifs structuraux qui devraient être conservés pour le développement de nouveaux inhibiteurs non nucléosidiques de DOT1L (figure 5.4) : le motif aminopyrimidine, un thiophène, un amide liant cet hétérocycle à une chaîne de 3 à 4 méthylènes porteuse d’un tert-butylphénylurée ou d’un tert-butyl-2-alkyl-benzimidazole.
Ainsi, cette étude a permis d’identifier de nouveaux points de départ à optimiser pour augmenter l’activité de nos composés, étant donné leur faible activité à 10 µM.
Etant donné que nous avons observé une activité supérieure pour les composés thiophéniques, comparés à leurs analogues benzéniques, des pharmacomodulations autour de cette série seront entreprises (figure 5.5).
Figure 5.5. Pharmacomodulations autour de la série thiophénique
La chaîne latérale portant un groupement de type tert-butylphénylurée ou tert-butyl-2-alkylbenzimidazole sera conservée avec un certain degré de liberté (-CHn-, n = 3, 4). La flexibilité de la chaîne permettra aux composés de mieux interagir dans la poche hydrophobe de l’enzyme via son motif aminopyrimidine (partie A). Des pharmacomodulations autour de la partie A seront proposées pour explorer davantage le site catalytique de DOT1L. Ainsi, l’introduction des substituants sur le N2 ou le N4 du motif aminopyrimidine, ainsi que la distance entre la partie A et la partie B seront évaluées. Ces modifications permettraient de mieux positionner le motif aminopyrimidine dans la poche hydrophobe tout en augmentant les interactions hydrophobes au sein du site catalytique.
L’activité de tous les composés sur DNMT3a a été déterminée à des concentrations de 100 µM, 32 µM et/ou 10 µM. Les composés benzéniques ALIPF244, ALIPF292 et ALIPF22, les composés phénoliques ALIPF229 et ALIPF213, ainsi que les composés thiophéniques ALIPF276 et ALIPF282, ont montré un pourcentage d’inhibition supérieur à 50 % (à une concentration de 32 µM) (figure 5.6).
Figure 5.6. Composés possédant une inhibition de DNMT3a supérieure à 50 % à une concentration de 32 µM A partir de ces résultats nous avons identifié des motifs structuraux à conserver pour le développement des inhibiteurs de DNMT (figure 5.7) : le motif aminopyrimidine, un thiophène ou un phénol, un amide liant cet hétérocycle à une chaîne de 3 méthylènes porteuse d’une phénylurée ou d’un benzimidazole. La phénylurée et le benzimidazole peuvent posséder un groupement volumineux comme un groupement tert-butyle ou trifluorométhyle.
Figure 5.7. Motifs à conserver pour le développement des inhibiteurs de DNMT
Figure 5.8. Pharmacomodulations pour des inhibiteurs de DNMT
Etant donné que le phénol semble favoriser l’activité sur DNMT, l’introduction d’un hydroxyle sur le thiophène (partie B) pourra être évaluée. Egalement, la position optimale de l’hydroxyle sur le phényle pourrait être déterminée. Les substituants sur le N2 ou le N4 du motif aminopyrimidine (partie A), ainsi que la distance entre la partie A et la partie B pourraient être modulés.
L’activité des composés représentatifs des séries développées a également été déterminée sur un panel d’HMTs SAM dépendantes (EZH2, G9a, PRMT1, PRMT4 et PRMT5) à une concentration de 32 μM.
D’une part, nous avons identifié les composés ALIPF199, ALIPF281 et ALIPF291 comme inhibiteurs de PRMT4 (CARM1), montrant un pourcentage d’inhibition supérieur à 90 % à une concentration de 32 µM (figure 5.9).
L’activité de ces composés sur PRMT4 sera déterminée à une concentration de 10 µM. L’inhibition de cette HMT est intéressante étant donné le rôle de cette enzyme dans le développement du cancer de la
prostate et du cancer du sein.[83–86]
D’autre part, d’autres composés ont été identifiés avec un profil plus ou moins sélectif (figure 5.10).
Figure 5.10. Figure 4.23. Composés montrant un profil d’activité plus ou moins spécifique
Nous avons observé que les composés synthétisés ne sont pas spécifiques, probablement dû à des interactions au niveau de l’ADN ou de la chromatine. Afin de confirmer ou non cette hypothèse, un test de liaison à l’ADN sera réalisée.
Le composé ALIPF292 présente une spécificité pour DNMT. Les composés ALIPF199 et ALIPF282 pourraient être intéressants pour le développement d’inhibiteurs mixtes DOT1L/DNMT. En effet, l’inhibition mixte est une approche intéressante étant donné que l’effet biologique pourrait être maximisé.[12–15] Ces structures peuvent servir comme point de départ pour réaliser des pharmacomodulations et aboutir à des inhibiteurs sélectifs de DOT1L ou de DNMT ou à des inhibiteurs mixtes.
Une fois les pharmacomodulations réalisées, les composés inhibiteurs de DOT1L les plus prometteurs seront évalués pour leur capacité à inhiber la prolifération de la lignée cellulaire MLLr (MV4-11) afin de valider l’effet sur la cible.
Parallèlement, l’évaluation de l’effet des molécules directement sur la di/triméthylation de H3K79 dans les cellules cancéreuses de MLLr sera réalisée par Western Blot.