Le cancer du poumon est le cancer le plus dévastateur au Canada. Non seulement il fait partie des cancers les plus fréquents, mais le taux de survie à 5 ans suivant le diagnostic ne dépasse pas 17%, faisant de celui-ci le cancer le plus meurtrier1-3. En plus de la perte humaine indéniable causée par cette maladie, les couts économiques colossaux engendrés par la prise en charge, le suivi et les pertes de productivités indirectes induites par la diminution physique des patients sont un poids considérable pour la société occidentale1, 4. Cette incidence est due, dans 80% des cas à la consommation tabagique, ainsi qu’à des facteurs environnementaux mis en contact direct avec l’épithélium pulmonaire par le processus respiratoire5-10. Ces particules toxiques dégradent l’ADN des cellules de l’arbre bronchique engendrant ainsi une multiplication anarchique de ces dernières et une perte d’inhibition de contact responsable de la formation des tumeurs. En plus d’une multiplication excessive, les cellules deviennent immortelles, favorisant une fois de plus le développement de masses au poumon. La capacité migratoire des cellules est également affectée, favorisant ainsi l’invasion et/ou l’infiltration conduisant au stade métastatique de la maladie. À ce moment précis, le cancer est capable de s’installer dans n’importe quel organe du corps.
L’un des nombreux obstacles liés à la prise en charge du cancer du poumon est le caractère asymptomatique18 des stades les plus précoces pour lesquels le taux de survie à 5 ans est de 45%. En effet, plus le cancer du poumon est diagnostiqué tôt dans le processus de cancérisation et plus les chances de déceler une tumeur localisée, sans invasion ni infiltration sont grandes. Un des autres obstacles majeurs réside dans la population touchée par le cancer du poumon elle-même. En effet, le développement des tumeurs pulmonaires se fait majoritairement après 70 ans, notamment à cause de l’accumulation d’une grande quantité de tabac consommée1, 12, 13. Toujours aux détriments de la prise en charge du cancer du poumon, les comorbidités associées à l’âge avancé ainsi qu’à la consommation tabagique ne facilitent pas non plus le diagnostic précoce et la prise en charge de la maladie12, 14, 15. Les relations cause à effet entre les comorbidités telle que la MPOC et le cancer du poumon sont encore à déterminer.
La mobilisation scientifique face à la caractérisation de cette maladie hétérogène qu’est le cancer du poumon est grandissante. Désormais, une approche personnalisée est favorisée en clinique. En effet, histologie, architecture cellulaire prédominante, tests moléculaires et immunologiques ou encore stadification tumorale, tout est mis en œuvre pour stratifier les tumeurs et ainsi administrer un traitement adapté à chaque patient 33, 36-43 41, 45-48, 81-92, 94-97, 100-109. Les tumeurs pulmonaires ont d’abord été divisées en deux catégories principales, les carcinomes non-à petites cellules ainsi que les carcinomes à petites-cellules. Les premiers représentant plus de 80% des cas de cancer du poumon. Ceux-ci ont ensuite été sous-divisés en
adénocarcinomes, carcinomes épidermoïdes et carcinomes à grandes cellules. Cette division a majoritairement été faite grâce aux critères histologiques et morphologiques de la masse cancéreuse. Les adénocarcinomes représentent plus de 40% de l’ensemble des cas de cancer du poumon, faisant de ce dernier le type histologique le plus fréquent1. Ces dernières années, les adénocarcinomes eux-mêmes ont connu une stratification supplémentaire44, 52. L’activité grandissante de l’histopathologie et de la pathologie moléculaire en clinique nous amène désormais à considérer séparément les adénocarcinomes in situ et les hyperplasies adénomateuses même si leur caractère précoce laisse entrevoir un bon pronostic vital dans un cas comme dans l’autre. Les adénocarcinomes minimalement invasifs ont quant à eux une invasion légère au niveau locale, mais leur taille ainsi que la prédominance cellulaire lépidique laisse également entrevoir un pronostic vital favorable. Les adénocarcinomes cités précédemment sont des stades I. En effet, la stadification selon les critères de l’IASLC, elle-même utilisée par les cliniciens, permet également de guider la prise en charge des patients. Une tumeur de moins de 5 cm sans invasion lymphatique et non-métastatique représente le portrait idéal pour entreprendre une chirurgie de résection curative sans traitement adjuvant pré ou post opératoire. Sans que nous en connaissions la cause, 30 à 50% des patients ayant subi une résection chirurgicale totale de la tumeur récidivent dans les 5 ans suivant l’intervention3. Aucun outil n’est actuellement disponible pour identifier les patients ayant un risque élevé de récidive et ceux dont la chirurgie a effectivement été curative.
L’objectif de ce projet de recherche était d’identifier des biomarqueurs d’expression génique afin de développer un modèle prédictif permettant d’accompagner les cliniciens dans la prise en charge des patients après chirurgie de résection d’un adénocarcinome de stade I. Autrement dit, nous souhaitions être en mesure d’identifier les patients ayant un fort potentiel de récidive. L’objectif à plus long terme étant de leur administrer un traitement adjuvant post-opératoire adapté, alors que pour ceux dont la chirurgie a été curative, éviter des sur-traitements pénibles et couteux.
Pour ce faire, nous avons sélectionné des gènes préalablement mis en relation avec la survie des patients dans la littérature scientifique81-92, 94-97. Force est de constater que ces derniers ne sont pas utilisés en clinique, nous avons essayé de comprendre les limitations de ces études et ainsi d’être en mesure de pallier à ces dernières. Les tumeurs pulmonaires ayant été considérées comme une entité à part entière, sans stratification, les cohortes étudiées étaient composés de types-histologiques multiples, dans des proportions variables afin de remédier à l’indisponibilité tissulaire. De plus, les tumeurs de différents stades pathologiques ont également été incluses au sein de mêmes cohortes, toujours pour augmenter la taille de l’échantillon. Autrement dit, le développement de tests moléculaires a été fait sur des profils moléculaires que l’on sait aujourd’hui différents33, 36-43.
Nous avons donc souhaité réaliser une validation des études d’expression des gènes du Tableau 2.1 par qPCR, technique de pointe de quantification des ARN messagers. En effet, nombreuses études ont choisi des plateformes telles les biopuces à ADN afin de considérer un grand nombre de gènes. Cependant, la validation par qPCR sur un échantillon de taille conséquente est requise pour s’assurer de la capacité du biomarqueurs à ségréguer les groupes avec une puissance statistique suffisante. Un test en qPCR est également plus facile à intégrer en clinique comparativement aux biopuces à ADN.
Nous avons également constitué une cohorte homogène palliant aux limitations des études précédentes, avec les données et tissus disponibles à la biobanque de l’IUCPQ. Notre cohorte, était composée exclusivement d’adénocarcinomes de stade I, les échantillons ont par ailleurs été analysés par un anatomopathologiste de l’IUCPQ directement après l’ablation chirurgicale. Nous avons également exclu les non-fumeurs de cette étude. De plus, les données cliniques ainsi que le suivi, excédent parfois les 10 ans, étaient disponibles à la base de données de la biobanque. Cela nous a également permis d’exclure les patients ayant subi des traitements adjuvants pré et post-opératoires, afin qu’il n’y a aucun biais au niveau de la survie du patient ainsi que de la qualité du tissu prélevé. Il est cependant important de souligner que le taux de survie à 5 ans des patients fumeurs et ex-fumeurs atteints d’un adénocarcinome de stade I opérés et suivis à l’IUCPQ entre 2002 et 2012 atteint 74%, ce qui est plus élevé par rapport aux données de la littérature.
Les analyses par qPCR dans notre première cohorte de validation ont mis en évidence la capacité des gènes EZH2 et RRM1 à discriminer les patients ayant un fort potentiel de récidive de ceux dont la chirurgie a été curative. Les analyses univariées démontrent que les patients ayant une expression supérieure à la médiane du groupe, ont une probabilité de survie significativement moins importante que les patients ayant une expression inférieure à la médiane. Les analyses multivariées démontrent que EZH2 comme RRM1 sont des biomarqueurs indépendants des critères cliniques (i.e. sexe, âge et stade pathologique). Des analyses additionnelles dans cette cohorte nous indiquent que le potentiel de EZH2 et de RRM1 surpasse celui des données cliniques en matière de stratification des risques. En revanche, les analyses de notre cohorte de validation ne montre pas de différence significative entre nos deux groupes, que ce soit pour le gène EZH2 comme RRM1. Après étude des potentielles raisons expliquant cet échec, nous avons mis le doigt sur une différence cruciale entre nos deux cohortes. En effet, notre deuxième cohorte, plus récente, a un taux de décès à 5 ans de seulement 15% contre plus de 28% pour notre première cohorte. Les analyses de Kaplan-Meier nous prouvent également que la probabilité de survie au sein de notre deuxième cohorte est significativement supérieure à celle de la première cohorte. En effet, le suivi des patients n’atteint pas encore 5 ans pour une grande partie des patients issus de la deuxième cohorte. À 5 ans, il y a moitié moins de patients
dans cette dernière comparativement à la première cohorte. Une année supplémentaire de suivi sera donc nécessaire à la pleine exploitation de ces données et à l’obtention de plus d’évènements dans notre deuxième cohorte.
En ce qui concerne le gène EZH2, les résultats de la première cohorte valident ceux obtenus par Behrens et al.81, ce qui suggère que la robustesse de ce dernier pourrait permettre son utilisation en clinique. À noter également que l’expression de la protéine EZH2 a également était mise en relation avec le développement des carcinomes non-à petites cellules, suggérant la possibilité d’une relation cause à effet entre celle-ci et la pathogenèse du cancer du poumon82. Celle-ci promeut le développement et la progression du cancer en induisant des modifications épigénétiques de la chromatine, ainsi qu’en activant des cascades de signalisation favorisant la mise sous silence de gènes suppresseurs de tumeurs via la voie de signalisation VEGF-A/AKT109. De plus, l’expression de cette protéine a été significativement corrélée à la mutation du gène KRAS, qui, comme décrit dans l’introduction agit sur la voie EGFR et promeut ainsi la prolifération cellulaire. La mutation de KRAS est majoritairement retrouvée chez les patients fumeurs atteints de carcinomes invasifs mucineux42. Cela confirme une fois de plus l’existence d’une association entre EZH2 et un mauvais pronostic vital. En effet, les carcinomes invasifs mucineux sont des cancers agressifs de stade avancés. L’expression de la protéine EZH2 a également était mise en corrélation avec l’expression de TTF-1. Comme énoncé dans l’introduction, TTF-1 est notamment utilisé en clinique pour ségréguer les adénocarcinomes des carcinomes épidermoïdes43. Il est également associé aux sous-types histologiques de bon pronostic vital à l’inverse de EZH2. Comme mis en évidence précédemment, les analyses immunohistochimiques demandent une quantité plus importante de tissu que les tests moléculaires. De plus, il semblerait que la détection immunohistochimique de TTF-1 soit de plus en plus difficile à mesure que le grade augmente, et par conséquent lorsque l’agressivité de la tumeur augmente72-74. Cela signifie que l’ARNm de EZH2 pourrait identifier les adénocarcinomes les plus agressifs, quelque soient leur stade et leur grade tumoral chez les fumeurs, sans nécessiter un bloc de paraffine pour l’immunohistochimie, surpassant ainsi les qualités de TTF- 1 comme biomarqueur. La relation entre le sous-type d’adénocarcinome et l’expression d’EZH2 reste quant à elle à confirmer. Si une surexpression d’EZH2 est associée à un pronostic vital plus faible, alors nous nous attendrions à ce que EZH2 soit surexprimé dans les adénocarcinomes à prédominance solide et micropapillaire. Autrement dit, EZH2 pourrait être à la fois un marqueur pronostic et diagnostique81, voire une potentielle cible thérapeutique110.
RRM1 quant à lui est l’exemple typique des controverses issues des études d’expression génique associée à la survie des patients dans le cadre du cancer du poumon. En effet, les résultats sont dépendants de la cohorte utilisée, et dans notre cas, la réalisation d’une cohorte homogène d’adénocarcinomes de stade I
n’a pas suffi à élucider la question. En effet, comme dans la littérature scientifique, notre étude sur la première cohorte et la deuxième démontre des résultats opposés. En effet, notre cohorte initiale a mis en évidence une association significative entre l’expression supérieure à la médiane de RRM1 et le mauvais pronostic vital des patients. Autrement dit, à l’inverse de l’article de Bepler et al 82 plus RRM1 est exprimé et moins les patients survivent longtemps après leur opération. Au contraire, notre cohorte de validation ne démontre aucune différence significative entre nos deux groupes. Nous pouvons donc supposer que pour RRM1, la caractérisation des prédominances cellulaires au sein des adénocarcinomes est nécessaire. Ce dernier pourrait alors être un facteur pronostique et diagnostique spécifique à un sous-type d’adénocarcinome, ou encore être spécifique aux autres profils histologiques de carcinomes pulmonaires tel que le carcinome épidermoïde. La protéine issue du gène RRM1 a également été associée à la réponse à un traitement de chimiothérapie. Une fois de plus, il a été démontré que l’abondance de RRM1 dans le tissu tumoral est associée à une réponse amoindrie des patients au traitement de chimiothérapie. RRM1 a alors été étudié comme potentiel cible thérapeutique à part entière109, 111, 112. Cette stratégie est une fois de plus discutable puisque la chimiothérapie est une thérapie adjuvante souvent utilisée en thérapie de seconde ligne lorsque la chirurgie n’a pu être curative, ou utilisé en première ligne de traitement pour les cas les plus avancés de cancer du poumon. Pour ces derniers, les analyses immunohistochimiques nécessitent, dans une majorité des cas, une nouvelle biopsie pour obtenir une quantité tissulaire adéquate à la réalisation de ces techniques. La biopsie devant être d’une taille suffisante pour s’assurer l’analyse d’un échantillon représentatif de l’ensemble de la tumeur, ce qui est souvent impossible lorsqu’il ne s’agit pas d’une ablation totale. Des contraintes de faisabilité clinique sont donc présente afin d’utiliser RRM1 comme biomarqueur de la réponse à la chimiothérapie.
Les 9 autres gènes en revanche n’ont pas démontré d’association significative entre leur niveau d’expression et la survie des patients atteints d’un adénocarcinome de stade I. Autrement dit, il est possible que l’association mise en évidence dans les études précédentes soit spécifique à un autre type histologique de cancer pulmonaire ou même à un sous-type d’adénocarcinome non-prédominant dans notre cohorte initiale. Cela peut également être en raison de notre choix d’analyser seulement des stades précoces. Ces gènes pourraient être associés aux stades avancés de la maladie expliquant ainsi l’absence de différence entre nos deux courbes dans le cadre de notre étude. D’autre part, nous ne pouvons pas exclure les biais de manipulations, puisque des techniques de prélèvements des échantillons jusqu’à la quantification des ARNm sont propices aux variations, même si les pratiques de laboratoires sont standardisées.
Les perspectives de ce projet représentent un véritable défi pour l’avenir de la prise en charge des adénocarcinomes pulmonaires de stade précoce. En effet, le développement de la médecine personnalisée
ainsi que les nouvelles stratifications suggérées par les guides internationaux en matière d’oncologie pulmonaire, posent la question de l’optimisation des tests moléculaires en fonction de ces nouvelles pratiques cliniques. Ainsi, il sera primordial de traiter les sous-types d’adénocarcinomes séparément. Les résultats obtenus pour les gènes RRM1 et EZH2 devront donc être reconsidérés en fonction des prédominances cellulaires des tumeurs utilisées pour réaliser la quantification des ARNm de nos gènes d’intérêt. Cela signifie qu’il faudra reprendre les patrons histologiques des 443 tumeurs de notre étude afin de stratifier la cohorte et potentiellement mettre en évidence des associations statistiquement plus robuste.
Au-delà de ce modèle, la multiplication des stratifications tumorales nous encourage également à penser à des modèles intégratifs regroupant plusieurs paramètres « omiques ». En effet, comme décrit précédemment pour les gènes EZH2 et RRM1, l’expression génique comme l’expression protéique est modulée dans la tumeur, de plus, la protéine EZH2 agit directement sur des modifications épigénétiques de la chromatine. Autrement dit, plusieurs types de signaux, associés à un même gène sont eux-mêmes associées à la cancérisation pulmonaire ou à la réponse thérapeutique du patient. Cela pose donc la question de quels types de marqueurs sont les plus robustes, et ceux dont la mesure et la combinaison sont réalisables cliniquement. En effet, les tests immunohistochimiques nécessitent l’obtention d’un bloc de paraffine spécifiquement pour ce genre d’analyse, ce qui est impossible lorsque l’ablation de la tumeur n’est pas totale ou que la biopsie ne permet par l’obtention d’une quantité suffisante de tissu. Dans la majorité des cas avancés, la rebiopsie est inenvisageable, et la biopsie par aspiration a aiguille fine ne permet pas l’obtention d’un échantillon suffisant pour la réalisation de ce genre de test 63. Au-delà de la disponibilité tissulaire, il faut également choisir une technique de pointe, aboutissant à des résultats statistiquement robustes, tout en minimisant les couts associés aux tests.
Finalement, notre étude, a mis en évidence deux biomarqueurs d’expression génique potentiels associés à la survie dans notre première cohorte de 233 patients opérés pour un adénocarcinome pulmonaire de stade I. Celle-ci nous a également permis de cibler les problèmes et de soulever les interrogations nécessaires au développement de modèles prédictifs robustes pour l’utilisation clinique. Plusieurs limites à notre propre étude ont d’ailleurs été mises en évidence. Malgré nos efforts pour créer des cohortes homogènes grâce à une meilleure stratification de nos échantillons, nous n’avons pas obtenu les résultats escomptés sur notre cohorte de validation.
Nous envisageons désormais d’améliorer la caractérisation phénotypique des tissus disponibles à la biobanque afin de stratifier nos cohortes d’adénocarcinomes, et notamment de mettre à jour notre stadification selon les recommandations de la 8ème édition de l’AJCC Cancer Staging Manual.
Nous souhaitons également considérer des marqueurs « omiques » multiples afin de créer des modèles intégratifs plus puissants. En effet, si les modèles basés sur l’expression génique exclusivement ne montrent que de modestes résultats afin de ségréguer les patients à risques, nous supposons que des études sur des phénotypes moléculaires multiples pourraient nous permettre d’obtenir des profils tumoraux plus précis d’une part, et nous donneraient aussi la possibilité d’intégrer les biomarqueurs les plus puissants au sein d’un même modèle prédictif optimal. Les marqueurs « omiques » sont entre autres les polymorphismes nucléotidiques simples, les données d’expression géniques, les données épigénétiques ou encore protéomiques. L’étude de ces phénotypes moléculaires n’a encore jamais été réalisée chez les mêmes patients, nous empêchant ainsi de combiner ces données dans un même modèle statistique. Face à l’hétérogénéité intra et interindividuelle, nous ne pouvons espérer l’émergence d’un biomarqueur commun à tout type de cancer bronchique, capable de prédire la récidive de ce dernier. Bien qu’il s’agisse d’un défit statistique et bioinformatique, multiplier la création de bases de données « omiques » sur des tissus pertinents divers est un espoir majeur vers la création de modèles intégratifs personnalisés afin d’améliorer le taux de survie à 5 ans des patients atteints d’un adénocarcinome pulmonaire de stade précoce.
Bibliographie
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