L’identification du contenu des VE est une étape-clé dans leur caractérisation. Il a été montré que les VE contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques tels que des ARNm, des miARN et des ARN non codants (Colombo et al., 2014) (Figure 10). Les composants des VE identifiés sont aujourd’hui répertoriés dans des bases de données telles que Vesiclepedia et EVpedia. Ainsi, 92897 protéines, 27642 ARNm, 4934 miARN et 584 lipides auraient été
49 identifiés dans les VE dérivées de 33 espèces différentes sur un total de 538 études selon Vesiclepedia (données de Septembre 2015). Ces données indiquent que les VE possèdent un contenu extrêmement riche de molécules et sont très hétérogènes dans leur composition.
Figure 10 : Composition des vésicules extracellulaires (par Colombo M, Annu Rev Cell Dev Biol, 2014).
Protéines
Le contenu en protéines a été investigué par plusieurs techniques : Western-Blot, microscopie immuno-électronique et plus récemment analyses protéomiques grâce à la spectrométrie de masse qui permet l’identification de toutes les protéines présentes (Raimondo et al., 2011). Ces analyses ont identifié des sous-populations de protéines conservées à travers les espèces, ce qui montre que les protéines sont empaquetées dans les VE de manière contrôlée et spécifique et non aléatoire. Parmi les protéines conservées, on retrouve des protéines impliquées dans la
50 structure vésiculaire et leur biogenèse telles que les tétraspanines (CD9, CD63 et CD81), des intégrines, des protéines de choc thermique (Hsp60, Hsp70 et Hsp90), les protéines de la machinerie ESCRT associées aux protéines Alix et TSG101, des annexines, des protéines du cytosquelette (actine, cofiline 1, profiline 1, tubulines, les protéines de la famille ezrine, radixine et moésine), des enzymes métaboliques, des protéines ribosomales et des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (Choi et al., 2013). Ces protéines ne sont pas uniformément réparties entre les différents sous-types de VE, certaines sont plus abondantes dans les exosomes et d’autres dans les MP ou les corps apoptotiques (Durcin et al., 2017; Kowal et al., 2016). Par exemple, les tétraspanines et les protéines de l’endosome seraient plus enrichies dans la fraction exosomale alors que les MP seraient plutôt enrichies en protéines ribosomales et en protéines du protéasome. Selon des études protéomiques, la composition des exosomes est différente de celle des MP (Durcin et al., 2017; Haraszti et al., 2016; Théry et al., 2009). De plus, les MP seraient plus proches de leurs cellules d’origine en termes de composition protéique que les exosomes. En effet, du fait de leur biogenèse, la membrane des MP est très proche de celle de leurs cellules mères. Les VE pourraient aussi contenir des molécules de signalisation cellulaire telles que β-catenine, Wnt5B ou le ligand de la protéine Notch, tout comme des médiateurs de voies de signalisation intercellulaires tels que l’interleukine 1-β, le TNF α ou le TGF-β (Urbanelli et al., 2013). Ces molécules pourraient directement influencer les cellules cibles des exosomes et entraîner des effets cellulaires en lien avec ces molécules. L’ensemble de ces études protéomiques ont permis d’identifier des protéines spécifiques d’un sous-type de VE alors que d’autres dépendent de la nature de la cellule d’origine. L’identification des protéines communes à un sous-type de VE pourrait permettre leur caractérisation et leur isolation spécifique afin d'étudier au mieux leur potentiel thérapeutique.
Lipides
Les lipides participent à la rigidité, à la stabilité, à la fonction et aux mécanismes de fusion intracellulaire et de bourgeonnement des VE. Les études lipodomiques ont permis d’identifier les composants lipidiques principaux des VE qui regroupent des lipides membranaires tels que la sphingomyéline, la phosphatidylcholine, la phosphatidylethanolamine, la phosphatidylsérine, le ganglioside GM3 et le phosphatidylinositol, des prostaglandines (E2, F2,
51 saturés (Durcin et al., 2017). Le rapport stœchiométrique de ces lipides diffère selon les sous- types de VE mais aussi selon la cellule d’origine des VE. Les exosomes seraient enrichis en ganglioside GM3 et en céramides et ces dernières seraient impliquées dans leur relargage dans le milieu extracellulaire indépendamment de la machinerie ESCRT (Trajkovic et al., 2008). L’acide lysobiphosphatidique est impliqué dans la formation des vésicules intra-luminales et serait, en revanche, absent dans les exosomes. La lysophosphatidylcholine est de même impliquée dans la formation des vésicules intra-luminales mais est aussi retrouvée dans les exosomes et représente environ 10% des phospholipides (Subra et al., 2007). Un taux plus élevé de phosphatidylsérine a été retrouvé dans les MP comparé aux exosomes, en accord avec leur biogenèse, puisque le bourgeonnement des MP résulte de la translocation de la phosphatidylsérine à la face externe de la membrane cellulaire. Les exosomes auraient ainsi une composition en lipides plus différente de leur cellule d’origine comparée aux MP. Les lipides présents peuvent s’organiser en micro-domaines enrichis en cholestérol et en sphingomyéline appelés radeaux lipidiques. Les VE peuvent contenir des lipides bioactifs pouvant induire des phénomènes biologiques. Par exemple, la sphingomyéline aurait un potentiel pro-angiogénique en stimulant la migration des cellules endothéliales, la formation de tubes vasculaires et la néovascularisation (Kim et al., 2002). De plus, l’exposition par translocation des phosphatidylsérines à la surface externe de la membrane des globules rouges, des plaquettes et des cellules endothéliales engendrerait la libération de MP ayant un effet pro-coagulant (Fu et al., 2010; Gao et al., 2012). Les prostaglandines associées à la membrane vésiculaire pourraient stimuler dans les cellules cibles des voies de signalisation intracellulaire liées à ces prostaglandines (Subra et al., 2010). De la même manière que les protéines, ces études montrent que les lipides seraient spécifiquement inclus dans les VE par un mécanisme qui n'est pas aléatoire.
Acides nucléiques
L’une des découvertes capitales dans la caractérisation des VE a été l’observation de matériel génétique tel que des ARNm et des miARN à l’intérieur des exosomes sécrétés par les mastocytes (Valadi et al., 2007). Cette étude fut la première à démontrer la communication intercellulaire par transfert de matériel génétique médié par les exosomes. Ce matériel génétique transféré peut être fonctionnel dans la cellule cible et induire un effet cellulaire ou une reprogrammation épigénétique, processus qui a été démontré in vitro et in vivo (Bobis-
52 Wozowicz et al., 2015; Deregibus et al., 2007; Ratajczak et al., 2006; Valadi et al., 2007). Les miARN présents dans les VE peuvent être délivrés à la cellule cible et atteindre leurs ARNm cibles, induisant ainsi une régulation de l’expression des gènes (Cantaluppi et al., 2012; Valadi et al., 2007; Yuan et al., 2009). Les VE serviraient de navettes pour le transport et le transfert de molécules jusqu’à la cellule cible de façon plus efficace que la seule transfection d’ARN (Deregibus et al., 2007) car les VE protègeraient les ARN de l’activité des RNases présents dans l’environnement extracellulaire. Bien que les mécanismes par lesquels les ARN sont empaquetés dans les VE soient difficiles à déterminer, des études ont montré que certains miARN sont spécifiquement incorporés dans les VE alors que d’autres restent dans leur cellule mère (Ogawa et al., 2013). Cette incorporation des miARN dans les VE serait sous le contrôle de la ribonucléoprotéine nucléaire A2B1 (hnRNPA2B1) (Villarroya-Beltri et al., 2013). Le type cellulaire pourrait spécifier le contenu en ARN à empaqueter dans les VE comme le suggère l'observation que les VE de CSEh sont enrichies en ARNm de facteurs de transcription pluripotents tels que NANOG, OCT4, GATA2 (Ratajczak et al., 2006). Les VE pourraient ainsi conserver une signature génétique de leur cellule d’origine. D’autres études, avec notamment des analyses transcriptomiques à haut débit, ont montré que les VE peuvent aussi contenir des ARN ribosomaux, des ARN de transfert, des ARN interférants, de l’ADN mitochondrial, des ARN longs non-codants et même, plus récemment, de l’ADN génomique double brin (Kalluri and LeBleu, 2017; Ogawa et al., 2013; Wahlgren et al., 2012; Yoon et al., 2014).