Coloration du frottis :

La coloration du frottis sanguin doit permettre d’identifier les éléments cellulaires en mettant en évidence les caractéristiques propres à chacun. [3]

Les hématologistes utilisent presque uniquement l’examen du frottis sanguin après coloration panoptique par des méthodes dérivées de celle de Romanovski (coloration de May-Grünwald Giemsa « MGG » et de Wright). [18]

Cette technique, en effet, met en relief un très grand nombre de caractère que nulle autre méthode ne permet d’apprécier simultanément. [18]

Elle donne presque tous les renseignements nécessaires à un diagnostic cellulaire correct, et c’est en raison, précisément, de son importance pratique pour le diagnostic des affections sanguines qu’elle a pris le pas sur les autres techniques d’étude cytologique. [18]

La coloration panoptique de MGG repose sur l’action complémentaire de deux colorants neutres : [19]

 Un colorant selon May Grünwald qui est composé d’un colorant acide, l’éosine et d’un colorant basique, le bleu de méthylène. [19]

 Un colorant selon Giemsa qui est composé lui aussi, d’éosine et d’un colorant basique qui est métachromatique, l’azur de méthylène. [19]

Le MG fixe le frottis par son méthanol, le MG dilué au ½ dans l’eau neutre colore les éléments acidophiles et les granulations azurophiles. [20]

Le Giemsa surcolore les noyaux et colore les granulations azurophiles. [20]

Etapes pré-analytiques : Séchage rapide et fixation au méthanol absolu. [21]

Les frottis doivent être séchés immédiatement après leur réalisation à l’air libre. [21]Ensuite, ils doivent être fixés après séchage pendant 3 à 10 minutes dans le méthanol absolu ou le May Grünwald pur en solution alcoolique. [21]

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 Exemples de procédé opératoire en méthode manuelle :

Premier temps : May-Grünwald pur (fixation)

La préparation à colorer est placée dans le couvercle d’une boite de Laveran, le frottis étant à la face supérieure de la lame. [18]On verse le nombre de gouttes (ou de ml) de May-Grünwald nécessaire pour que les frottis soient entièrement couverts. [21]Le colorant est laissé en place trois à dix minutes. [21]L’alcool méthylique dans lequel il est dissous a pour effet de fixer les frottis qui n’ont pas besoin, dans ce cas, d’autre fixation. [18]Les frottis ne présentent encore aucune coloration, les colorants n’étant pas ionisés dans l’alcool méthylique pur. [18]

Deuxième temps :

On ajoute autant d’eau tamponné à ph 6,8 (v/v) que de May-Grünwald : 3 à 5 minutes. [21]L’homogénéité du mélange est obtenue par quelques mouvements imprimés à la boite. [18]

Troisième temps : Coloration de Giemsa [21]

On élimine le May-Grünwald dilué et, sans laver, on passe les lames dans la solution Giemsa. La durée de la coloration est de 10 à 30 minutes. Les frottis sont

ensuite lavés sous un fort courant d’eau (1 à 2 minutes), puis séchés. Il est recommandé d’utiliser une eau tamponnée : tampon de ph optimal 6,8Préparation

extemporanée de la coloration Giemsa30 ml d’eau tamponnée + 15 gouttes de Giemsa (ou Giemsa à 10 %dans le tampon) Frottis si possible à la face inférieure pour éviter les précipités sur les lames. [21]

 Résultats de la coloration panoptique (Avec la coloration de May-Grünwald-Giemsa) : [18]

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Les éléments : Couleur au frottis sanguin :

Les noyaux ^{Rouge-violet (basi-chromatine) et roses}

(oxy-chromatine)

Les cytoplasmes basophiles Varient du bleu ciel au bleu foncé

Les cytoplasmes acidophiles Roses

Les cytoplasmes polychromatophiles ^{Grisâtres avec des zones rosées et}

d’autres bleutées

Les granulations neutrophiles Marron, rose sale

Les granulations acidophiles

(éosinophiles) ^Orangées

Les granulations basophiles

(métachromatiques) ^{Violet foncé}

Les granulations azurophiles Pourpre ou violet-pourpre

Les granulations basophiles des

érythrocytes ^{Bleu cobalt}

Le « Laboratoire Central d’Hématologie du CHU Ibn Sina de Rabat » utilise l’appareil semi-automatique de coloration RAL Stainer (figure 7) afin de confectionner des lames de bonne qualité et standardisées.

Il s’agit d’un système automatisé de coloration compact, simple, intelligent et sûr pour la coloration complète de frottis sanguins utilisé en combinaison avec les réactifs de coloration sans méthanol MCDh ( Micro Chromatic Detection for Haematology). [22]De plus, le temps de coloration est diminué de moitié par rapport aux méthodes manuelles. (Résultats obtenus en 11 minutes identiques à ceux obtenus avec les colorants traditionnels en 20 minutes). [22]L’autre avantage considérable de cet automate de coloration concerne la possibilité d’accomplir d’autres tâches en toute confiance, même lorsque le processus de coloration est en cours. [22]

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MCDh est une méthode de coloration panoptique de type MGG. Formulé sans méthanol, elle est constituée d’une séquence de quatre réactifs spécifiques (MCDh 1, MCDh 2, MCDh 3, MCDh 4 concentré) utilisés dans la différenciation et le comptage des cellules sanguines et médullaires. [22]

Les réactifs MCDh sont fournis dans des conditionnements fermés pour prolonger leur durée de vie et élimine tout risque de contamination. Une puce RFID permet d’éviter l’utilisation des réactifs au-delà de leur date d’expiration ce qui réduit davantage les risques d’erreur. Les réactifs MCDh sont prêt à l’emploi et sont utilisés les uns après les autres et toujours dans un ordre spécifique au sein du colorateur. [22]

La grande rapidité de l’automate de coloration est due à la possibilité de charger 10 lames par porte-lames, qui est ensuite placé dans l’un des deux tiroirs de chargement. Il suffit d’appuyer sur le bouton Start et le porte-lame est plongé dans chacune des 5 stations de coloration. Le protocole de coloration standard MCDh a été optimisé pour les frottis sanguins périphériques, colorés en 13 minutes. [22]

 Avantages clés du RAL Stainer : [22]

Simple Kit de préparation prêt à l’emploi pour un chargement direct

Aucune préparation des colorants

Protocoles de coloration personnalisable

Sécuritaire Mécanisme fiable et robuste

Aucune exposition dangereuse

Un filtre au charbon actif neutralise les vapeurs des colorants Vidange automatique des colorants usagés

Intelligent RFID (identification par radiofréquence)

Détection et gestion automatique des kits de réactifs Traçabilité de la performance des cycles de coloration Détection des niveaux de liquide de rinçage et d’effluents

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 Mécanismes de coloration : [22]

MCDh 1 Il s’agit d’un mélange de colorants neutres utilisé pour fixer les frottis et

préparer la coloration, principalement des éléments hydrosolubles (granulations basophiles). Ces colorants ne sont pas actifs dans un milieu alcoolique et ne s’activent de manière sélective que lorsqu’ils sont libérés dans une solution aqueuse tamponnée.

MCDh 2 Ce réactif mène à la concentration et la précipitation du colorant sur les

hématies, le cytoplasme des granulations neutrophiles et sur les granulations éosinophiles

MCDh 3 Il est utilisé pour colorer le cytoplasme des monocytes et des lymphocytes et

exécuter la coloration métachromatique des granulations azurophiles en rouge

MCDH 4 Il s’agit d’un liquide de rinçage pour enlever l’excès de colorant et finaliser la

coloration.

 Caractéristiques techniques : [22]

Kit de réactifs MCDh pour RAL Stainer : (figure 6)

 Prêt à l’emploi

 Capacité de coloration maximale 500 lames

 Durée de conservation 18 mois avant ouverture, 20 jours après ouverture  Température de stockage entre 15° c et 30° c

Débit : (selon le protocole de coloration utilisé)

 Protocole de coloration standard 11 minutes  Cycle de séchage : 2 minutes

 Coloration, 4 bains de coloration et 1 bain de rinçage  2 Stations de chargement.

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Figure 6: KIT RAL STAINER MCDh. [22]

 Mode opératoire : [22]

RAL Stainer est un appareil semi-automatique de bain de coloration.

Le bras de l’automate suit une trajectoire circulaire et verticale successivement :  Il accroche le porteur de lames déposé par l’utilisateur ;

 Apporte le porteur de lames dans chaque réservoir de colorations et ensuite dans le réservoir en fonction de l’enregistrement protocole ;  Fait retourner le porteur de lames à sa position initiale

 Les lames sont ensuite séchées. La coloration est ainsi terminée.

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Figure 7: Automate semi automatique RAL STAINER du Laboratoire Central d’Hématologie de CHU Ibn Sina de Rabat.