Chapitre III RESULTATS ET DISCUSSION
D. Identification et étude fonctionnelle d’une famille d’ABC transporteur
D.2. Collection de mutants
Dans le but d’identifier des gènes impliqués dans la dégradation oxydative des substrats hydrophobes chez les levures, des mutants étiquetés, affectés dans ces voies ont été produits précédemment par insertion aléatoire d'une cassette de mutagenèse MTC dans le génome de Y. lipolytica. Environ 9600 transformants Ura+ ont été sélectionnés, par des tests sur boites, pour leur capacité à utiliser les alcanes (C10, C16), l'acide oléique et la tributyrine. Des mutants incapables de se développer en présence d’alcanes ou d’intermédiaires de cette voie ont été isolés. Afin d’identifier les gènes affectés, les sites d'insertion de la cassette MTC ont été séquencés par PCR convergentes et divergentes. L'analyse des séquences résultantes a mis en évidence des gènes (connus et inconnus) impliqués dans l'utilisation des substrats hydrophobes. Par exemple, l'insertion de la cassette MTC des mutants AlkD/E s'était produite dans les gènes de la réductase de thiorédoxine, des peroxines PEX14 et PEX20, du transporteur de succinate-fumarate SFC1, et de l'isocitrate lyase ICL1. Plusieurs mutants étaient également affectés dans l'utilisation d'alcanes selon la longueur de la chaîne carbonée.
L’ensemble de cette étude est présentée dans l’article « Characterization of Yarrowia
lipolytica mutants affected in hydrophobic substrate utilization » en annexe 3 (Thevenieau et al., 2006). Seuls les résultats relatifs aux mutants affectés dans l’utilisation d’alcanes selon la
Les mutants, N046, B095, Z110, présentent ce phénotype et une seule insertion de la cassette de mutagénèse. Le mutant N046 est incapable de se développer sur hexadécane, alors qu’il a un phénotype sauvage de croissance sur décane (Figure 40). Le mutant B095 présente un phénotype identique. A l’inverse, le mutant Z110 se développe sur hexadécane mais est incapable de croître sur décane.
Figure 40. Tests de croissance sur boite en présence d'alcane de différentes longueurs de chaîne carbonée.
Les souches testées sont : la souche sauvage H222 (wt), le mutant N046 (C10+, C16-) et le mutant Z110
(C10-, C16+). Une préculture sur YPD est réalisée durant une nuit. Celle-ci est centrifugée et resuspendue à
DO600 1. Des aliquots de 10 µL issus de différentes dilutions (non dilué, 10-1, 10-2) de cette suspension cellulaire
sont déposés sur un milieu minimum en présence de décane (C10) ou d’hexadécane (C16).
D.2.1.
ANT1 est requis pour l’utilisation des alcanes à chaîne courte
Des croissances en culture liquide de la souche sauvage H222 et du mutant Z110 ont été suivies en présence d’alcanes de différentes longueurs de chaîne (C10 à C16, Figure 41). La souche sauvage présente des croissances similaires quelle que soit la longueur de chaîne de l’alcane avec une vitesse µmax de 0,249 +/-0,015h-1 (Figure 41A). Le mutant Z110 présente une faible croissance sur C10 (µmax < 0,027 +/-0,02h-1) et sur C11 (µmax < 0,065 +/-0,02h-1). En présence de C12, une croissance est observée et les taux de croissance augmentent avec la longueur de la chaîne aliphatique jusqu’à un taux de croissance identique à la souche sauvage en présence d’hexadécane (µmax : 0,145 +/-0,015h-1 sur C12 ; 0,157h-1 sur C13 ; 0,165h-1 sur C14 ; 0,174h-1 sur C15 et 0,245 +/-0,015h-1 sur C16 ; Figure 41C).
Le mutant Z110 présente une interruption du gène YALI0E03058g qui code une protéine de 315 acides aminés semblable à la protéine Q06497 (YPR128c/ANT1) chez S. cerevisiae. Ces protéines appartiennent à la famille de transporteur comportant également les transporteurs
C16
N046 Z110 wt
Ant1p appartient à la famille de protéines GLC.1419 et est très conservée parmi les levures hemiascomycètes (http://cbi.labri.fr/Genolevures/fam/GLC.1419.html). Chez S. cerevisiae, plusieurs études ont montré que Ant1p (YPR128c) était requise dans l’utilisation des acides gras à chaîne moyenne (MCFA) (Lasorsa et al., 2004Palmieri et al., 2001Rottensteiner et al., 2002van Roermund et al., 2001). Ant1p est responsable du transport d’ATP dans les peroxysomes nécessaire à l’activation des MCFA dans les peroxysomes. On notera qu’un second gène de fonction inconnue, YALI0C06127g, apparenté à ANT1, a été identifié dans le génome de Y. lipolytica. 0,01 0,1 1 10 100 0 20 40 60 80 Temps (h) C ro is sa n ce (A 60 0) 0,01 0,1 1 10 100 0 20 40 60 80 Temps (h) C 0,01 0,1 1 10 100 0 20 40 60 80 Temps (h) B C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 B C A wt N046/B095 Z110 0,01 0,1 1 10 100 0 20 40 60 80 Temps (h) C ro is sa n ce (A 60 0) 0,01 0,1 1 10 100 0 20 40 60 80 Temps (h) C 0,01 0,1 1 10 100 0 20 40 60 80 Temps (h) B C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 B C A wt N046/B095 Z110
Figure 41. Comparaison de la croissance de mutants sur alcanes de longueur de chaîne différente.
Les souches de Y. lipolytica itlisées sont la souche sauvage H222 (A), le mutant N046 (B) et le mutant Z110 (C). La croissance est testée dans des fioles à baffles sur milieu minimum YNBY complété par 0,15% d’extrait de levure et de 1% d’alcane comme sources de carbone. Les alcanes utilisés sont le décane (C10, ) ; le undécane (C11, ) ; le dodécane (C12 , ) ; le tridécane (C13, ) ; le tétradécane (C14, ) ; le pentadécane (C15, ) et l’hexadécane (C16, ). Des cultures dans 50 mL de YNBY dans des fioles sont inoculées avec des cellules issues d’une préculture d’une nuit sur YPD à une DO600 initiale de 0,05.
D.2.2.
ABC1 est requis pour l’utilisation des alcanes à chaîne longue
Les croissances en culture liquide sur alcanes du mutant N046 montrent, à la différence du mutant ANT1, une altération de leur capacité à se développer plus la longueur de chaîne de l’alcane est importante (Figure 41B). En effet, nous observons une croissance similaire à celle de la souche sauvage en présence de C10 et C11. A partir de douze atomes de carbone, la croissance est altérée (µmax : 0,078 +/-0,015h-1). Une phase de latence de 40h est observée en présence de C13 (µmax : 0,075 +/-0,015h-1). Enfin, ces mutants sont incapables de se développer en présence de C14, C15 et de C16.L'analyse des séquences du site d’insertion de la cassette de mutagenèse chez le mutant N046 et le mutant B095, présentant tous deux le même phénotype (C10+, C16-), a été réalisée. Pour ces deux mutants le gène YALI0E14729g est interrompu à deux endroits différents. Ce gène code une protéine de 1659 acides aminés et est homologue au gène PDR5 de S. cerevisiae qui code un ABC transporteur P33302 (YOR153w). Elle appartient à la famille de protéines Genolevures GLC.1360 (http://cbi.labri.fr/Genolevures/fam) qui contient cinq membres chez Y. lipolytica (codées par les gènes YALI0E14729g, YALI0C20265g, YALI0B02544g, YALI0B12980g et YALI0F17996g). Nous avons nommé ABC1, le gène YALI0E14729g et les autres ABC2 à ABC5, respectivement.
L’étude des mutants N046 et B095 a permis de démontrer l’implication de abc1p dans l’utilisation des alcanes à longue chaîne carbonée. Cependant deux questions restent en suspens : Quelle est la fonction de la protéine codée par ABC1 ? Les autres membres de cette famille sont-ils également impliqués dans l’utilisation des substrats hydrophobes (alcanes, acides gras, DCA) ?
C’est pourquoi, nous avons initié l’étude fonctionnelle de cette famille multigénique. Dans un premier temps, nous avons réalisé une analyse par génomique comparative puis une analyse fonctionnelle. Des souches mono- et multidisruptées ont été construites afin de mesurer leur croissance sur substrats hydrophobes ainsi que leur sensibilité aux drogues. Enfin, nous nous sommes focalisés sur abc1p afin de déterminer sa localisation cellulaire et sa fonction.