As amplificações obtidas por Duplex-PCR e BOX–PCR foram verificadas pela migração de 8 µl de cada produto PCR, mediante electroforese em gel de agarose a 1,5% (w/v) e 2% (w/v), respetivamente, preparados em tampão TBE 0,5x. As bandas de ADN foram marcadas com GelRedTM (Biotium Inc., Hayward, CA, USA) incluído no gel. A migração realizou-se durante 1 hora (Duplex-PCR) e 1 hora e 30 minutos (BOX-PCR), sob corrente
32 constante (100 V) numa tina Horizon 11-14 da Life-Technologies®. O tamanho das bandas de ADN amplificadas foram comparadas através da inclusão de um marcador molecular de 100 bp (BIORON DNA Ladder) nos géis de agarose correspondentes ao Duplex- PCR, e um marcador molecular de 1 Kb (BIORON DNA Ladder) nos géis de agarose das amplificações BOX-PCR. Os géis foram visualizados com luz ultravioleta (Sambrook et al., 1989) e as imagens registadas e gravadas em suporte informático no formato JPEG.
33
Resultados e Discussão
1.
Acompanhamento das prospecções oficiais de Psa em pomares na
Região de Entre Douro e Minho nos anos de 2016 e 2017
O acompanhamento da realização das prospecções oficiais realizadas pela APK permitiu ter uma visão mais real e detalhada da situação atual dos pomares atacados por Psa, particularmente na região de EDM, através das visitas aos pomares, tanto aos mais recentes como aos mais antigos. Estas permitiram também, perceber as estratégias adotadas pelos produtores para gerirem os seus pomares com a presença ou ameaça da Psa.
No ano de 2016 visitaram-se 9 pomares, e apenas 1 não apresentou sintomas típicos de Psa, sendo este o pomar mais novo (dois anos desde a plantação). Em 2017 visitaram-se 3 pomares, e em dois observaram-se sintomas do cancro bacteriano. A colheita de amostras e o resultado das análises em laboratórios oficiais acreditados, juntamente com os registos das informações recolhidas, seguindo as metodologias descritas no ponto Material e Métodos, apresentam-se no Quadro 4.
O resultado da confirmação da presença da bactéria nestes pomares foi divulgado em dezembro de 2016, pelos serviços oficiais, sob a forma de um mapa (Anexo 1 e 2 e Figura 9) das várias regiões e concelhos, sendo indicado as freguesias que tinham pomares prospetados em 2016 e que tiveram resultados positivos para Psa, mostrando que a região de Entre Douro e Minho é aquela onde a incidência da doença é maior, comparativamente com a região da Beira Litoral (Anexo 3).
Os resultados da prospeção de 2017 foram revelados pela Engenheira Alexandra Gomes da APK em setembro, sendo notificada que o pomar com a cv. G3 foi o único dos três visitados com resultados negativos para Psa. Os outros dois pomares com a cv. Hayward, apresentaram resultados positivos para Psa (Quadro 4).
Considerando a informação sobre a dispersão de Psa em 2015 (DRAPN, 2015) e a informação reunida durante as prospeções que acompanhamos em 2016 e 2017, verifica-se que em 2015 (Anexo 2), o número total de freguesias em que foi confirmada a presença de Psa é de 69, sendo o concelho de Felgueiras o que teve mais pomares positivos. Em 2016, o número de freguesias com pomares infetados com Psa subiu para 78, demonstrando a capacidade da bactéria para se disseminar entre pomares, a longas distâncias. Neste ano, o concelho de Felgueiras continua a ser o que apresenta maior número de pomares infetados e localizados em diferentes freguesias. Em 2016, através dos dados oficiais, verificou-se também um aumento significativo da dispersão de Psa no concelho de Santa Maria da Feira.
34 Os sintomas verificados ao longo das visitas aos pomares foram bastante idênticos, devido ao facto de as visitas terem sido realizadas durante o verão, sendo esta a estação do ano em que os sintomas são mais reduzidos devido às condições meteorológicas desfavoráveis e às infecções latentes que possam existir nos pomares.
No caso das adubações e tratamentos fitossanitários influenciam em muito os resultados positivos nos pomares, como é o caso do pomar em Vila Verde, cujas adubações eram excessivas e frequentes, tornando os ramos bastante vigorosos e sensíveis a qualquer dano que possa provocar uma porta de entrada para a bactéria.
Sendo as explorações de pequena dimensão, também se verifica algum descuido por parte dos produtores em proteger a cultura da bactéria, pois o valor dos tratamentos é elevado e, portanto, a rentabilidade final do produtor é reduzida.
Figura 9. Mapa das prospecções do ano de 2016 com os concelhos reconhecidos como área não livre de Psa (azul) e as freguesias positivas para a presença de Psa (vermelho) (adaptado de DRAPN, 2016).
35 Positivo-primeiro resultado positivo neste concelho
Pomar Localização Área (ha) Nº plantas/ha Idade do pomar
Cultivares Sintomas típicos presentes Tratamentos fitofarmacêuticos
Resultado da análise laboratorial
Concelho Freguesia ♀ ♂ Produtos Época
A Arcos de
Valdevez
Sabadim 1,3 - 2 Hayward - - - - Negativo
B Vila Verde Cabanelas 6 400 29 Hayward - Pontuações necróticas nas folhas,
necroses nas flores, abortamento floral
Bion® 50 WG
Nordox® 75
WG
floração Positivo
C Felgueiras - 0,5 - 14 Hayward K1 Pontuações necróticas nas folhas,
necroses nas flores, abortamento floral, exsudados avermelhados
Cobre fim da colheita e fim da poda
de inverno Negativo D Cabeceiras de Basto Arco de Baúlhe e Vila Nune
7 700 4 Hayward - Pontuações necróticas nas folhas Cobre após poda de inverno Positivo
E Celorico de
Basto
- 4 740 5 Hayward - Murchidão dos ramos, abortamento
floral, pontuações necróticas nas folhas
- - Positivo
F Amarante - 1 - 26 Hayward - Pontuações necróticas nas folhas,
abortamento floral
Cobre fim da colheita e fim da poda
de inverno
Negativo
G Amarante - 7 - 16 Hayward - - Cobre fim da colheita e fim da poda
de Inverno
Negativo
H Paços de
Ferreira
- 1 - 16 Hayward - Pontuações necróticas nas folhas,
abortamento floral
Cobre fim da colheita e fim da poda
de Inverno
Positivo
I Paredes Sobrosa - - - Hayward - Pontuações necróticas nas folhas,
abortamento floral
- - Positivo
J Paredes Sobreira 1 400 4 G3 M109 Pontuações necróticas nas folhas Nordox® 75
WG pós-colheita, pós-poda de inverno, antes do abrolhamento, antes da floração Negativo
K S.M.Feira Pigueiros 2,30 800 1 Hayward M52 - Calda
bordalesa
após poda de Inverno Positivo
L S.M.Feira São Paio
de Oleiros
2,50 800 4 Hayward - Pontuações necróticas nas folhas Nordox® 75
WG Calda bordalesa
antes da floração após poda de Inverno
36