Co-migration ? – Activité ?

La présence d’une bande de poids moléculaire plus lourd dans le gradient de sucrose, chez le contrôle dans les conditions anoxiques, n’est-elle due qu’à une unique co-migration des complexes impliqués dans le CEF ? Ou ce regroupement protéique en une bande unique correspond à une association fonctionnelle ?

Des études fonctionnelles, in vitro, de la bande identifiée comme la formation des supercomplexes dans la membrane thylacoïdale chloroplastique montraient une activité, par les cinétiques d’absorptions. Nous avons attribué cette observation d’activité à une participation spectrale des longueurs d’ondes de la plastocyanine, et non au fonctionnement des supercomplexes.

1.1 Transfert d’électrons cyclique au sein du CEF-supercomplexe

Les études de mesures de cyclique ont permise d’étudier les chemins métaboliques de réinjection des électrons dans le mode CEF dans la membrane thylacoïdale. Et d’évaluer les différentes hypothèses par l’utilisation de mutants altérés dans les unités pensées pour être impliquées dans le cyclique (pgrl1 (Tolleter, Ghysels et al. 2011) ; pgr5 (Alric. 2014)). Le transfert d’électrons cyclique a lieu dans ces mutants mais l’augmentation du CEF n’étant pas observé suggère une implication des protéines mutées dans la restructuration des différents acteurs cyclique en CEF-supercomplexes permettant une efficacité fonctionnelle de ces CEF-supercomplexes et du transfert d’électrons.

L’étape suivante est donc l’étude de la formation des CEF-supercomplexes chez les mutants pgrl1 et pgr5 de Chlamydomonas reinhardtii. Des études préliminaires montrent qu’il y a présence de supercomplexes chez ces deux mutants mais pas dans le double mutant (expérience pgr5, au sein de notre laboratoire et pgrl1, pgr5 et le double mutant de Janina Steinbeck (laboratoire de Münster)).

2 Mutants de diffusion des transporteurs d’électrons – formation des CEF-supercomplexes

Toujours dans l’optique d’observer une activité in vitro des CEF-supercomplexes chloroplastiques, nous cherchons à ‘consolider’ cette formation.

Plutôt que de tester différent protocole biochimique d’étude, nous avons à notre disposition des mutants qui présentent de plus haute affinité, que le contrôle, pour la ferrédoxine et le PSI pour l’un, et de la plastocyanine pour le PSI pour le second mutant.

Il est donc possible en limitant la diffusion des deux transporteurs mobiles entre les deux complexes principaux (PSI et cytochrome b6f) du CEF-supercomplexes, de

modifier le flux d’électrons cyclique et ainsi d’étudier son efficacité dans, entre autre, la formation des supercomplexes.

2.1 Mutant T26 – Limitation de la diffusion entre PC et PSI

Le cœur du Photosystème I se construit des deux sous unités PsaB et PsaA, arborant la paire de chlorophylle P700 et le centre fer-soufre [4Fe-4S]Fx. Il est montré que la sous unité chargée négativement, possède deux résidus E613 et D612 importants pour l’efficacité de la déconnection de la plastocyanine oxydée venant du complexe PSI.

Le mutant T26 est issu d’un transformant PsaB-D612H/E613H, chez l’algue verte

Chlamydomonas reinhardtii (Kuhlgert, Drepper et al. 2012). Il présente lors des descriptions des interactions électrostatiques entres les partenaires du transfert d’électrons (PC – cyt – PSI), une haute affinité de la plastocyanine au Photosystème I en comparaison au contrôle.

Les études de variations d’absorptions montrent des temps de réduction de P700+ plus rapide. Le transfert d’électrons par l’examen de la photo-réduction du NAP+, in vitro, montrent une vitesse trois fois plus élevée que chez le contrôle WT.

Le mutant T26 présente donc une plus haute affinité pour réduire la PC et permet un transfert d’électrons plus rapide entre la plastocyanine et le Photosystème I que chez la souche contrôle.

Nous avons donc étudié ce mutant dans les conditions oxique et anoxique afin de mesurer les vitesses cycliques.

Notons tout d’abord que la transition entre états bloqué et débloqué est plus rapide chez le mutant que chez notre souche de référence. Les vitesses cycliques montrent des valeurs, pour la souche T26, d’une moyenne (sur 6 échantillons) de 54 ± 21 électrons s-1 PSI-1 pour les conditions oxiques et de ~84 ± 22 électrons s-1 PSI-1 pour les conditions anoxiques.

Pour conclure sur l’oxydation de P700 et le taux CEF important observé dans les conditions oxiques chez le mutant T26, il serait bon de comparer ces valeurs avec celle du contrôle de la souche, que nous ne possédons pas encore.

Nous pouvons cependant conclure que comme chez notre contrôle d’étude (t222+) une augmentation du cyclique est observé lors de la transition conditions oxique – anoxique.

Nous envisageons d’étudier la formation de CEF-supercomplexe dans le mutant

T26 dans les deux conditions, pouvant émettre l’hypothèse que dans les conditions

anoxiques, l’affinité entre la plastocyanine et le Photosystème I favorise un transfert d’électrons entre le cytochrome b6f et le PSI au sein de l’entité que forme le

supercomplexe. La plastocyanine pourrait donc se trouver piégée et permettrait l’observation d’une activité efficace du CEF-supercomplexes.

2.2 Mutant PsaC-FB1 – Limitation de la diffusion entre PSI et Fd

Le Photosystème I est composé de sous unité dont les rôles sont variés, allant du bon assemblage de ce dernier à l’interaction entre ferrédoxine et PSI, permettant un transfert d’électrons efficace. Les deux sous unités PsaE et D sont connues pour être responsables de la haute affinité de la Fd pour le PSI, dans des proportions

différentes. PsaE semble contrôler le temps de vie du complexe PSI/Fd, alors que le PsaD apparait important pour la connexion entre la Fd et le site de liage du PSI (Barth, Lagoutte et al. 1998). Les auteurs ont montré qu’en leurs absences, les

propriétés principales du Photosystème I sont conservées comparé au WT, malgré la perte importante de l’affinité du couple Fd/PSI. Au-delà, les données présentées supportent l’existence d’un site de liaison étendu pour la ferrédoxine, principalement partagé entre PsaC-D-E.

La sous unité du PSI, PsaC-FB1 contient les centres fer-soufre [4Fe-4S]FA, et se situe côté stromal. Elle est identifiée pour avoir un site d’interaction avec la ferrédoxine

(Setif 2001) et jouerait un rôle dans le contrôle géométrique du complexe PSI-Fd requit pour un transfert d’électrons rapide (Barth, Lagoutte et al. 1998).

2.2.1 Analyses spectroscopiques – Résultats préliminaires

Les expériences de flash d’ECS montrent un déclin de champ différent que le contrôle, dans les conditions oxiques. Celui est beaucoup plus lent chez le mutant

PsaC-FB1, comme ce qu’il est possible d’observer chez le contrôle dans les conditions

anoxiques.

L’application pendant 30 secondes de lumière suivie de 10 secondes d’obscurité et de nouveau l’étude de champ montre cette fois une consommation plus rapide du champ produit.

Le mutant PsaC montre donc une activité à deux facettes de l’ATP synthase. Ce complexe fonctionne correctement comme le montre l’application de la lumière. Cependant son activité est différente de celle du contrôle, pour des raisons qui ne sont pas encore identifiables pour le moment. Dans les conditions oxiques, l’ATP synthase arrête son activité spontanément, et la reprend lorsque les cellules ont été précédemment exposées à la lumière.

Il est possible d’imaginer que le transfert de protons n’est pas optimal, par exemple, ne permettant pas une accumulation suffisante pour observer un fonctionnement de l’ATP synthase. Il serait intéressant dans un premier temps de reproduire ces résultats, et d’étudier le retour du fonctionnement de l’ATP synthase en fonction de l’intensité et du temps d’exposition des cellules à la lumière.

De plus, nous avons étudié l’oxydation de P700 chez le mutant PsaC-FB1 qui ne montre pas d’oxydation totale dans les conditions anoxiques après 40 minutes,

Figure 7 : Cinétiques d’oxydo-réduction de P700 chez le mutant PsaC-FB1 dans les conditions oxiques (courbe grise) et à différents temps d’anoxie (5, 10, 20, 40) minutes. Intensité de 115

µE m-2 s-1.

Les cinétiques de la figure montrent que l’oxydation de P700 après 40 minutes (courbe rouge) n’est que partielle (56 %). La vitesse cyclique dans les conditions oxiques est de 48 électrons s-1 PSI-1, qu’il faudrait comparer avec celle du contrôle de la souche, que nous ne possédons pas.

Ces résultats suggèrent que l’état métabolique des cellules est différent que le contrôle. Il semble qu’il est possible de désengorger le pool de NADPH mais lentement, comme le montre la courbe rouge à 40 minutes.

Il serait intéressant de suivre l’oxydation de P700 chez le mutant PsaC-FB1 à des temps plus long d’anoxie. Mais aussi d’étudier ce mutant en appliquant la lumière au début de l’anoxie pour permettre une éventuelle oxydation de P700 par la synthèse d’ATP chloroplastique.