Nous présentons ici les deux mutants utilisés durant nos premières études
(chapitre 1) un peu plus en détails. 1.1 Mutant stt7-9
La distribution de l’énergie excitatrice entre les deux Photosystèmes I et II est contrôlée par le processus appelé transition d’états. Elle implique une réorganisation des fractions mobiles des complexes périphériques antennaires du PSII.
Ce processus consiste en une migration des antennes LHCII du PSII dans la membrane thylacoïdale qui permet de rediriger l’énergie lumineuse capturée préférentiellement par le PSII, lorsque celui-ci est fortement excité, vers le PSI, et inversement.
La transition des antennes est corrélée avec la phosphorylation réversible de nombreuses protéines LHCII.
Figure 1 : Etude de phosphorylation des protéines antennaires du mutant stt7 et du contrôle chez Chlamydomonas reinhardtii (Fleishmann, Ravanel et al. 1999).
Illustré sur la phosphorylation de la protéine in vivo et in vitro, la figure 1 montre que le mutant stt7 est déficient dans celle-ci. Stt7 est incapable de mettre en œuvre la transition d’antennes qui normalement a lieu lors de la transition de l’état 1 à l’état 2, et reste bloqué à l’état 1 même dans des conditions redox qui promeuvent l’état 2.
De plus, la fluorescence à 77 K montre des spectres similaires chez le mutant, dans les deux conditions redox, conduisant à la conclusion que les antennes mobiles LHCII sont préférentiellement connectées aux PSII. Il en est de même pour les mesures photo-acoustiques qui indiquent que les antennes Chl a et b restent fortement connectées aux PSII sous les deux types de conditions.
Les auteurs concluent à une mutation affectant la kinase, rendant le mutant stt7 incapable d’opérer la migration de ces antennes mobiles périphériques dans la membrane thylacoïdale et restent donc bloqué à l’état 1 indépendamment de l’état redox des cellules (Fleishmann, Ravanel et al. 1999).
1.2 Mutant ptox2
La protéine PTOX fait partie de la chaîne de transport d’électrons chlororespiratoire
(Bennoun. 1982, Peltier and Cournac 2002). Son rôle exact est encore discuté, mais il semblerait que deux l’emporte. Celui qui serait que PTOX préviendrait de la sur-réduction du pool de PQ, comme une valve de sécurité (Nigoyi. 2000). Mais aussi intervient dans la synthèse des caroténoïdes.
PTOX est aussi présentée comme un mécanisme auxiliaire (avec Ndh1, Ndh2, PGR5, PGRL1) qui a contribué à l’adaptation des microalgues photosynthétiques dans les environnements changeant (Peltier, Tolleter et al. 2010).
Chez Chlamydomonas reinhardtii, il existe deux gènes codant pour les oxydases PTOX1 et PTOX2. Le mutant ptox2 a été généré par transformation avec une cassette de marqueur de sélection aphVIII (Houilles, Rappaport et al. 2011).
Figure 2 : Schéma de l’insertion de la cassette aphVIII dans le gène ptox2 (Houilles, Rappaport et al. 2011).
Les clones obtenus sont triés selon leur résistance et les données de fluorescence chlorophylle pour déterminer les phénotypes pouvant être lié à une mutation PTOX2 L’étude des flux d’électron avec estimation de l’état redox du pool de PQ à
l’obscurité, permet aux auteurs de proposer le model suivant,
Figure 3 : Model pour la chlororespiration à l’obscurité impliquant les trois protéines PTOX 1 et 2, et NDA2, dans la représentation des flux d’électrons avec et sans inhibiteurs (Houilles,
Chez le mutant ptox2, le pool de PQ est majoritairement réduit conduisant les cellules dans les conditions oxie et anoxie, à être à l’état 2 à l’obscurité.
1.3 Nos études des deux mutants – Publication
Lors de l’étude de ces deux mutants nous avons caractérisé nos souches selon les observables qui viennent d’être décrites.
Voici les études de fluorescence des mutants et du contrôle, ainsi que la phosphorylation des protéines antennaires chez les deux mutants et le contrôle d’étude, que nous avons publié (Takahashi, Clowez et al. 2013),
Figure 4 : (a) phosphorylation des protéines antennaires et (b) fluorescence à 77 K des mutants stt7 et ptox2 et du contrôle de C. reinhardtii, dans différentes conditions ; oxiques
obscurité et lumière en présence de DCMU et anoxie, (Takahashi, Clowez et al. 2013). Dans nos conditions d’études les cellules sont maintenues à l’obscurité et sont agitées pendant 30 minutes. Les conditions anoxiques sont induites par l’ajout de glucose, glucose-oxydase et de catalase (informations complémentaires par la suite). La figure 4a nous montre que le mutant ptox2 a des quantités d’antennes phosphorylées similaires dans les conditions oxiques à l’obscurité et en anoxie. De plus, son profil de phosphorylation est le même que celui du contrôle à l’état 2, indiquant bien que le mutant ptox2 est à l’état 2 dans les deux types de conditions, à l’obscurité. Ces résultats sont confirmés par les spectres de fluorescence à froid (figure 4b).
Le mutant stt7 montre une légère phosphorylation des sous unités antennaires CP43 mais reste similaire entre les deux conditions, et ne suffit pas à induire le changement d’état comme le montre les spectres de fluorescence à 77 K. Le mutant stt7 est bloqué à l’état 1 indépendamment de l’état redox des cellules.
2 Chapitre 2
La caractérisation des différentes situations d’oxydation de P700 (chapitre 2) dans les conditions anoxiques ont nécessité l’utilisation du mutant d’hydrogénase. Nous donnons ici quelques informations complémentaires sur cette enzyme.
2.1 Mutants d’hydrogénase
La production d’hydrogène est due à l’induction de l’enzyme hydrogénase durant les conditions anaérobiques. C’est par l’implication de maturases, enzymes intervenant dans la maturation, que l’hydrogénase à centre fer [FeFe] est assemblée. Les mutants utilisés durant cette thèse sont nommés HydEF (posewitz) et HydG (Ghysels, Godaux et al. 2013).
Les trois maturases identifiées HydE, F et G montrent des activités de l’hydrogénase différentes dans les études de caractérisation in vitro de ces maturases. La méthode d’étude consiste dans un échantillon contenant une ou deux maturases, à analyser l’effet de l’absence et la présence à différentes concentrations de la ou des autres maturases.
Figure 5 : Mesures de l’activité de l’hydrogénase selon présence ou absence des maturases, in vitro, HydE (A), HydF (B) et HydG (C) en fonction du temps d’incubation anoxique
(Kuchenreuther, Britt et al. 2012).
Les courbes de la figure 5 (ronds noirs) montrent une activité de l’hydrogénase faible dépendant du temps d’anoxie d’activation, lorsque les maturases Hyd E et F sont absentes, il en est de même pour les solutions dépourvues des deux maturases
HydEF. Cependant, sans la présence de la maturase HydG, il y a une complète
absence d’activité de l’hydrogènase.
Les auteurs concluent que la maturase HydG est indépendamment assemblée des deux autres HydE et F selon le model proposé suivant (Kuchenreuther, Britt et al. 2012),
Figure 6 : Model d’assemblage des trois maturases de l’hydrogénase : HydG, E et F, (Kuchenreuther, Britt et al. 2012).
La position de la maturase HydG en tant que précurseur peut expliquer que, sous l’hypothèse qu’elle est assemblée séparément, les mutants Hyd E et F présentent une activité hydrogénase, le précurseur HydG étant toujours présent (Kuchenreuther, Britt et al. 2012).
II Inhibiteurs
Cette section vise à donner quelques informations supplémentaires sur les inhibiteurs utilisés.