Application de la lumière – Méthode

2.1.1 Application de la lumière – Méthode

La stratégie que nous avons suivie est de mettre les cellules en anoxie, à l’obscurité et d’attendre les 5 minutes où la situation observée est une impossibilité d’oxydation de P700. Une illumination constante est ensuite appliquée sur les cellules et nous mesurons après le pulse de lumière saturant, la quantité de P700 photo-oxydable induit à la lumière.

Les cinétiques montrant l’évolution de la fraction de P700 photo-oxydable en fonction du temps d’illumination sont présentées figure 10. La lumière est appliquée sur les cellules de façon continue après 5 minutes d’anoxie à l’obscurité.

En créant un gradient de protons à la lumière, les cellules peuvent synthétiser par le biais de l’ATP synthase de l’ATP, et utiliser le NADPH qui est présent en grande quantité au début de l’anoxie, par le cycle de Benson-Calvin.

Dans un premier temps, nous avons testé notre hypothèse sur la souche contrôle (t222+).

Figure 10 : Cinétiques représentant l’évolution de la quantité de P700 photo-oxydable chez le contrôle (t222+) de C. reinhardtii, selon le temps de l’illumination. En rouge, les cellules sont

illuminées et en noire elles sont gardées à l’obscurité entre chaque point de détection (évolution d’oxydation de P700 dite spontanée). Intensité de 115 µE m-2 s-1.

La cinétique en noire de la figure 10 montre la récupération progressive de la capacité à oxyder P700, dans les conditions anoxiques, lorsque les cellules sont maintenues à l’obscurité. Au tout début de l’anoxie la fraction photo-oxydable dépasse à peine les 20 % puis présente une évolution traduisant une oxydation partielle, ~80 % à 15 minutes, puis totale à 30 minutes d’anoxie.

La cinétique en rouge montre, lorsque les cellules sont exposées à la lumière continue, une oxydation totale de P700 après seulement 90 s de lumière.

La comparaison entre ces deux cinétiques indique qu’il existe une voie métabolique dépendante de la lumière qui permet de désengorger le pool de NADPH accumulé dès les débuts de l’anoxie.

Il est intéressant de noter que ce ‘’déblocage’’, bien que très rapide, est transitoire car si nous coupons la lumière après les 2 minutes requises pour 100 % de la fraction de P700, il redevient impossible d’oxyder totalement P700 à la lumière, tout au moins dans les premières minutes de l’anoxie. Après 10 minutes de condition anoxique à la lumière, ce phénomène transitoire n’est plus complètement observable.

Il est donc possible d’induire la levée de la limitation côté accepteur du PSI et ainsi d’avoir accès à la quantité totale de P700 photo-oxydable par l’application du pulse saturant. L’expérience permet également de calculer le flux généré par le

Photosystème I selon la méthode que nous avons développée dans (Takahashi, Clowez et al. 2013).

Nous voulons mesurer la vitesse cyclique dans les conditions anoxiques chez le contrôle en utilisant l’oxydation de P700 photo-induite. La souche contrôle est à l’état 2 dans nos conditions d’études, cependant l’état 1 peut être induit par la lumière en présence de DCMU (inhibiteur utilisé ici).

La courbe d’oxydation de P700 nous donne accès au rendement de photo-oxydation mais pour l’exprimer en termes de flux, nous devons connaître la vitesse photochimique. Il est donc important de savoir si l’état 1 à été induit à la lumière, la vitesse photochimique n’étant pas la même qu’à l’état 2, et ne conduisant donc pas à un même calcul de la vitesse cyclique.

Par les mesures de fluorescence nous avons donc vérifié l’état des antennes après les 2 minutes d’illuminations que nous jugeons nécessaire pour l’oxydation totale de P700

à la lumière.

Figure 11 : Cinétiques de fluorescence à température ambiante sur le contrôle (t222+) dans les conditions oxique (carré bleu) et anoxique (t=5 min) (rond rouge) lorsque les cellules sont

gardées à l’obscurité. Et dans les conditions anoxiques, sous illumination, après totale oxydation de P700 (triangle orange) et à un temps long de lumière (étoile verte). Intensité de

115 µE m-2 s-1.

L’émission de fluorescence des chlorophylles à température ambiante représente la réémission de l’énergie lumineuse que le PSII n’a pas la possibilité de convertir, via la chaîne photosynthétique.

Les cinétiques montrent qu’au temps où nous obtenons une fraction de P700 photo-oxydable maximale, à 1,5 minutes, les cellules de la souche contrôle sont toujours à l’état 2. L’état 1 n’est promu qu’après un temps plus long d’illumination (environ 7 à 10 minutes de lumière).

Sachant que les cellules, après deux minutes de lumière, présentant une oxydation totale de P700 sous anoxie, sont toujours à l’état 2, nous pouvons maintenant estimer les rendements d’oxydation de P700 par la lumière en termes d’électrons par seconde par PSI en fonction du temps d’application de la lumière.

Figure 12 : Représentation des estimations des taux cycliques en termes d’électrons s-1 PSI-1 pour le contrôle (t222+) de C. reinhardtii à l’intensité de 115 µE m-2 s-1 en fonction du temps

d’illumination des cellules, courbe noire. Conditions anoxiques à l’obscurité jusqu’à 5 minutes puis application de la lumière et application de pulses saturants tout au long du temps de l’anoxie. La ligne rouge indique la vitesse CEF obtenue dans les cellules contrôles

lorsque celles-ci sont adaptées à l’obscurité et mesurée après 40 minutes d’anoxie. La figure 12 montre des vitesses rapides au tout début de l’illumination excédant 125 d’électrons s-1 PSI-1. Aux vues de nos expériences de champ, nous avions conclu qu’il existe, à ces temps courts d’anoxie, un CEF efficace mais qu’à celui-ci s’ajoute la recombinaison de charge. C’est ce que nous sommes capable d’observer par des mesures de cyclique très importante avec des valeurs de plus de quatre fois celle obtenue à 40 minutes d’anoxie.

La vitesse cyclique diminue au cours de l’illumination en fonction de la fraction de P700 photo-oxydable qui augmente. Elle atteint une valeur de 58 électrons s-1 PSI-1

mettre le système dans une situation débloquée. Or cette vitesse est plus rapide que celle que nous obtenons dans les conditions à l’obscurité, de 29 électrons s-1 PSI-1

(courbe rouge). A ce temps d’illumination nous savons qu’il n’y a plus de recombinaison de charge, cette vitesse de cyclique de 58 d’électrons par seconde correspond donc à une importante capacité du système à fonctionner en mode cyclique. Ceci montre que la valeur de la vitesse de cyclique dépend du temps d’illumination et donc de l’état métabolique de la cellule.

Il semble nécessaire pour obtenir des valeurs similaires entres les deux approches d’attendre 2,5 minutes d’illumination (figure 12).