Classification de l’ensemble des sulfatases par famille

On compte à ce jour 3 groupes distincts de sulfatases classées par homologies de séquences d’acides aminés. Le groupe I regroupe les sulfatases à formylglycine (Figure IG-39a) dont font d’ailleurs partie toutes les sulfatases humaines, le groupe II rassemble les sulfatases dépendantes du fer (Figure IG-39b), enfin le groupe III réunit les sulfatases β-lactamases (Figure IG-39c).

138

Figure IG-40 : Séquence consensus considérée comme la signature des sulfatases (Hanson et al., 2004)

Alignement partiel de gènes de sulfatases. Les résidus hautement conservés sont visualisés en blanc sur fond noir ; les autres résidus conservés de façon significative sont visualisés sur fond gris. Les codes d’accession ExPASy sont donnés, ou la référence de la littérature dans les cas échéants.

Contrairement aux sulfatases du groupe I, qui partagent de très fortes similarités de séquences, les sulfatases des groupes II et III présentent des séquences hautement divergentes, compliquant ainsi la découverte de ces protéines par les recherches de génomiques.

D.2.1 Famille I : Les sulfatases à formylglycine (FGly)

La majorité des sulfatases connues à ce jour appartiennent au groupe I : les sulfatases à Formylglycine (FGly). Souvent appelées « arylsulfatases », ces enzymes sont extrêmement répandues chez les procaryotes et les eucaryotes. Une des particularités de ces sulfatases est qu’elles doivent subir une modification post-traductionnelle au niveau de leur site actif pour être fonctionnelles (Schmidt et al., 1995 ; Dierks et al., 1998 ; Landgrebe et al., 2003). Cette modification consiste en une oxydation d’un résidu de cystéine (sulfatases Cys-type présentes chez les eucaryotes et les procaryotes), ou de sérine (sulfatases Ser-type uniquement chez les procaryotes) qui aboutit à la formation d’un acide aminé modifié : le 3-oxoalanine couramment appelé la Cα-formylglycine (FGly) (Boltes et al., 2001). Cette transformation se produit pendant ou immédiatement après la traduction, avant le repliement de la sulfatase (Schmidt et al., 1995). Le résidu Cα-Formylglycine est présent au sein d’un motif particulier défini par la séquence (C/S)x(P/A)xR, et qui est considéré comme la signature des sulfatases (Bajorova & Williams, 2008). Cette séquence consensus de 12 acides aminés est strictement conservée chez toutes les sulfatases à formylglycine (Figure IG-40) (Hanson et al., 2004), et est décrite comme essentielle pour la conversion, mais aussi pour la conformation du site actif. Des mutations dans ce site actif ou dans les régions attenantes, entraîne une diminution de l’affinité du substrat ou de la stabilité de la sulfatase (Recksiek et al., 1998 ; Dierks et al., 1999 ; Waldow et al., 1999). Par conséquent, les sulfatases sont des protéines difficile d’accès en production hétérologue, parce qu’il faut tenir compte de cette modification post-traductionnelle particulière et des divers mécanismes de modification existants.

Les sulfatases de la famille I partagent diverses caractéristiques. Elles présentent une taille relativement similaire, entre 500 et 800 acides aminés. Ce sont des protéines largement glycosylées. Enfin, elles partagent de remarquables homologies de séquences (entre 20 et 60% d’identité) sur la longueur totale de la protéine, et en particulier dans la région N-terminale qui contient la séquence consensus. Par conséquent, ces sulfatases présentent un site

140

Figure IG-41 : Structure cristalline de l’arylsulfatase A humaine (ARSA) (PDB : 1AUK)

(Buono & Cosma, 2010)

(A) Visualisation des différents domaines.

(B) Représentation détaillée du domaine B de la région N-terminale qui contient la séquence consensus CXP(X/S)R dans la poche de fixation du substrat.

actif hautement similaire qui conduit à une modification post-traductionnelle unique (Diez-Roux & Ballabio, 2005). Les fortes similarités de séquence alliées aux analogies structurales de ces enzymes, suggèrent qu’elles ont évolué à partir d’un gène ancestral commun (Hanson et al., 2004). Par ailleurs, des ressemblances significatives ont été observées entre les sulfatases à formylglycine et des phosphatases alcalines, notamment au niveau du site actif, suggérant un mécanisme catalytique similaire et une évolution commune de ces deux familles de protéines (Diez-Roux & Ballabio, 2005). Des similitudes entre les sulfatases et les phosphatases ont aussi été observées d’un point de vue structural.

 Structure cristalline

La comparaison des structures cristallines (toutes « Cys-type ») de trois sulfatases humaines (Bond et al., 1997 ; Lukatela et al., 1998 ; Hernandez-Guzman et al., 2003) avec une sulfatase bactérienne issue de Pseudomonas aeruginosa (Boltes et al., 2001) a montré qu’elles présentaient une structure tridimensionnelle hautement similaire, en plus d’une région fondamentale superposable, qui constitue le site actif de ces enzymes (Hopwood & Ballabio, 2001 ; Boltes et al., 2001). Les structures cristallines des sulfatases à formylgycines apparaissent comme des monomères relativement sphériques et sont caractérisées par 4 domaines (Figure IG-41A) (Hanson et al., 2004 ; Buono & Cosma, 2010). Les domaines A, B et C, hautement conservés, participent à la formation de la région N-terminale. Celle-ci présente plusieurs hélices α entourées par 10 grands feuillets β. Le domaine B inclut le site actif (Figure IG-41B) dans lequel les acides aminés peuvent atteindre jusqu’à 90% de similarités entre les sulfatases, révélant ainsi des régions peu variables, essentielles pour la fonction enzymatique. Le site actif des sulfatases contient un ion métallique divalent localisé dans la poche de fixation du substrat. La région C-terminale, moins conservée, inclut le domaine D. Elle est constituée par un petit feuillet β anti-parallèle, étroitement associée à une hélice α. La majeure partie de leur structure secondaire (hélices α et feuillets β) est conservée chez tous les membres des sulfatases de la famille I.

La résolution récente de deux structures cristallines de sulfatases « Ser-type » issues de Bacteroides fragilis et de Bacteroides thetaiotaomicron (Structures non publiées mais accessibles sur la PDB) montre deux domaines additionnels qui seraient spécifiques des sulfatases « Ser-type » (Bojorova & Williams, 2008).

142

Figure IG-42 : Systèmes de maturation des sulfatases (chez les procaryotes) (Benjdia et al., 2007)

Figure IG-43 : Formation de la Cα-Formylglycine (A) et rôle dans le mécanisme des sulfatases de la famille I (B) (Maire, 2003)



 LLeesseennzzyymmeessddeemmaattuurraattiioonnddeessssuullffaattaasseessààffoorrmmyyllggllyycciinnee

Chez les eucaryotes, présentant uniquement des sulfatases « Cys-type », la conversion post-traductionnelle est catalysée via la Formylglycine Generating Enzyme (FGE). En revanche, chez les procaryotes, la formation du résidu Cα-formylglycine est catalysée par au moins 3 systèmes enzymatiques différents (Figure IG-42) (Benjdia et al., 2007), mais deux seulement sont actuellement identifiés.



 LLaaFFoorrmmyyllggllyycciinneeGGeenneerraattiinnggEEnnzzyymmee::FFGGEE

Le premier système de maturation repose sur la FGE (Formylglycine-Generating

Enzyme). L’implication de cette enzyme dans la machinerie post-traductionnelle des

sulfatases de la famille I est relativement récente, puisqu’elle n’a été mise en évidence qu’en 2003 (Dierks et al., 2003). La FGE appartient à la famille des oxygénases et utilise donc de l’oxygène moléculaire (O2), ainsi qu’un agent réducteur encore non identifié, pour catalyser l’oxydation aérobie du résidu cystéine en Cα-Formylglycine. La FGE est spécifique des sulfatases « Cys-type ». Elle oxyde un résidu cystéine dans la séquence consensus et forme ainsi, par l’apparition de la fonction aldéhyde, le résidu Cα-Formylglycine (Figure IG-43A) (Schmidt et al., 1995). Par la suite, la Cα-Formylgycine, sous forme d’hydrate d’aldéhyde, peut former, après attaque nucléophile grâce à l’un de ses groupes hydroxyles, un intermédiaire covalent avec le groupement sulfate, puis le libérer grâce à son autre groupe hydroxyle (Figure IG-43B).

On retrouve la FGE chez l’homme et dans certaines bactéries. La FGE humaine a été clonée et se situe dans le réticulum endoplasmique (Dierks et al., 2003). La première structure cristalline d’une FGE procaryotique a été résolue à partir de Streptomyces coelicolor, une homologue de la FGE de Mycobacterium tuberculosis (Carlson et al., 2008). La topologie globale de cette FGE bactérienne présente de remarquables similarités avec celle de la FGE humaine(Dierks et al., 2005). En effet, toutes deux présentent une petite structure secondaire contenant 16% d’hélices α et 12% de feuillets β, et partagent le repliement devenu caractéristique des FGE (Figure IG-44). La principale distinction réside dans le nombre d’ions Ca²⁺ stabilisant la structure : un seul pour la FGE de S. coelicolor et 2 ions pour la FGE humaine (Carlson et al., 2008). Les sites actifs des deux FGE sont remarquablement

144

Figure IG-44 : Superposition de la structure de la FGE de S. coelicolor (en vert) avec celle de la FGE humaine (en gris) (Carlson et al., 2008)

Les éléments de la structure secondaire de S. coelicolor sont indiqués. Les ions Ca2+ sont schématisés par les sphères.

Figure IG-45 : Mécanisme proposé pour la réaction de maturation catalysée par les AnSME (Benjdia et al., 2008)

Le cluster [4Fe-4S]⁺ réduit de l’AnSME interagit avec l’AdoMet, et clive par réduction l’AdoMet en méthionine et en un radical 5’-déoxyadénosyl radical (Ado˙). Celui-ci extrait un proton à partir d’un résidu sérine ou cystéine, amenant à la production d’un 5’-déoxyadénosine et à la formation de la Formylglycine (FGly).

similaires avec une taille identique et la possibilité d’accueillir seulement 6 des 12 (13 suivant les publications) acides aminés définissant la signature des sulfatases.

Le rôle de la FGE est crucial pour le fonctionnement des sulfatases et son dysfonctionnement peut entraîner des conséquences extrêmement graves. En effet, la maladie d’Austin est causée par une déficience de la conversion post-traductionnelle de la cystéine en C-formylglycine, en raison d’une mutation du gène SUMF1 codant pour la FGE (Lukatela et al., 1998).



 LL’’AAnnaaeerroobbiiccSSuullffaattaasseeMMaattuurraattiinnggEEnnzzyymmee::AAnnSSMMEE

Le second système de maturation implique l’AnSME (Anaerobic Sulfatase Maturating Enzyme), qui appartient à la superfamille des enzymes radicaux AdoMet (S-adénosyl-L -méthionine) (Berteau et al., 2006). Elle a été découverte en premier chez Clostridium perfringens, puis, par grâce à des BLASTS du motif (C/S)XAXR (la signature des sulfatases maturées) a été mise en évidence chez de nombreuses autres bactéries des phyla bactériens majeurs (Proteobacteria, Planctomycetes, Cyanobacteria, Bacteroidetes). Cette enzyme est à substrat double car capable d’hydrolyser l’oxydation des résidus cystéine et sérine en Cα-formylglycine (Figure IG-45) (Benjdia et al., 2008). Contrairement à la FGE, l’AnSME est capable d’activer les sulfatases dans des conditions anaérobies. Néanmoins, le mécanisme par lequel ces enzymes catalysent l’oxydation des résidus cystéine et sérine, est encore obscur mais des mécanismes détaillés hypothétiques commencent à émerger (Benjdia et al., 2010). Toutefois, il a été démontré qu’en plus du motif Cx3Cx2C qui se lie au cluster [4Fe-4S]²⁺ commun à tous les membres de la superfamille des radicaux AdoMet, les AnSME possèdent deux clusters cystéinyles conservés additionnels avec des fonctions inconnues. Ces clusters se lient à deux autres clusters [4Fe-4S]²⁺ et sont indispensables à la conversion post-traductionnelle (Benjdia et al., 2010).



 LLeessyyssttèèmmeeddeemmaattuurraattiioonndd’’EEsscchheerriicchhiiaaccoollii

Le troisième système de maturation est celui de E. coli, encore inconnu, dépendant de l’oxygène et permettant la conversion spécifique des sulfatases « Cys-type » (Benjdia et al., 2007). E. coli est généralement considérée comme privée d’activité sulfatase, bien que 3 gènes de sulfatase, qui pourraient être essentiels à la pathogénicité des souches d’E. coli, sont prédits dans le génome de E. coli K12. Par ailleurs, il a été démontré qu’E.coli est capable de maturer efficacement diverses « Cys-type » sulfatases hétérologues mais pas les « Ser-type ». Cela suggère qu’une ou plusieurs enzymes de maturation des sulfatases, qui restent à être identifiées, jouent un rôle critique dans E. coli. Aucune enzyme apparentée à la FGE n’est présente chez E. coli. Cependant, dans le génome d’E. coli, 2 gènes aslB et ydeM codent pour des AnSME potentielles et sont localisées dans les opérons des sulfatases prédites. Elles représentent donc d’excellents candidats susceptibles de coder pour des enzymes de maturation de sulfatases « Cys-type » (Benjdia et al., 2007). Le système de maturation de E. coli est aérobie et probablement présent dans d’autres bactéries.

D.2.2 Famille II : Les sulfatases dioxygénases Fe(II)-α-kétoglutarate dépendantes

Les sulfatases dioxygénases Fe(II)-α-kétoglutarate dépendantes constituent un deuxième groupe de sulfatases (Müller et al., 2004). La superfamille des dioxygénases Fe(II)-α-kétoglutarate dépendantes présente une grande variété d’enzymes répandues chez les organismes eucaryotes et procaryotes. Elles catalysent des réactions de biosynthèse et de biodégradation. Les dioxygénases dépendantes de l’α-kétoglutarate sont classées suivant leurs caractéristiques biochimiques et dépendent de fer non hémique. Les sulfatases de ce groupe sont uniquement exprimées en conditions limitées de sulfate par les bactéries (Müller et al., 2004). Elles coupent de façon oxydative les esters sulfatés en sulfate inorganique et en aldéhyde correspondant, et nécessitent à la fois de l’oxygène et un α-kétoglutarate comme co-substrats. L’enzyme « décarboxyle » une molécule d’ α-kétoglutarate (αKG) en succinate par molécule d’esters sulfatés clivée.

148

Figure IG-46 : Structure cristalline de l’alkylsulfatase AtsK de P. putida S-313 (PDB : 10IH)

La résolution de la structure cristalline de l’alkysulfatase AtsK de Pseudomonas putida S-313 a été résolue (Müller et al., 2004). Cette sulfatase appartenant à la superfamille des dioxygénases Fe(II)-α-kétoglutarate dépendantes (Kahnert & Kertesz, 2000), la résolution de sa structure a permis de révéler en partie le mécanisme des sulfatases de cette famille. Ainsi, le repliement global de ces enzymes présente le motif « Jelly roll » caractéristique de la superfamille des dioxygénases Fe(II)-α-kétoglutarate dépendantes (Figure IG-46), hébergeant le site actif dans le domaine central. Elles utilisent un « 2-his-1-carboxylate facial triad » dans leur centre catalytique et présentent des motifs communs d’acides aminés. Les principales différences parmi les structures de cette famille résident dans des insertions ou des extensions de la région C-terminale.

D.2.3 Famille III : Les sulfatases métallo-β-lactamases

Les sulfatases métallo-β-lactamases dépendantes du zinc forment le groupe III (Hagelueken et al., 2006). L’expression des β-lactamases est le mécanisme le plus connu de résistance aux antibiotiques parmi les bactéries. Ces enzymes ont été groupées en 4 classes (de A à D) en concordance avec leurs homologies de séquences. Les classes A, C et D présentent un résidu sérine sur leur site actif comme nucléophile, alors que la classe B des lactamases (généralement appelées métallo-β-lactamases : MβLs) emploie un ou deux ions Zn (II) pour couper les cycles β-lactames. Les sulfatases du groupe III présentent le repliement caractéristique des métallo-β-lactamases et en forme le groupe 13. Le premier membre du groupe III des sulfatases est la protéine SdsA de Pseudomonas aeruginosa. Elle ne présente pas de similarité de séquences avec les sulfatases des groupes I et II, mais des homologues de gènes (37% de similarités de séquences) ont été trouvés dans de nombreuses eubactéries. Les homologues eucaryotes, probablement acquis par une α-protéobactérie, sont moins fréquents.

150

Figure IG-47 : Structure cristalline de l’alkylsulfatase SdsA1 de P. aeruginosa (PDB : 2CG3) Les domaines structuraux sont différenciés par un code couleur : en bleu, le domaine N-terminal ; en vert, le domaine de dimérisation ; en rouge-orange, le domaine C-terminal. Les ions Zn²⁺ sont schématisés par des sphères jaunes.

Figure IG-48 : Structure cristalline de la protéine homologue à ElaC issue de Bacillus anthracis (PDB : 1ZKP)

La structure cristalline de cette première sulfatase du groupe III a été établie (Figure IG-47). On y compte 3 domaines distincts : un domaine catalytique N-terminal avec un cluster binucléaire Zn²⁺ (caractéristique du repliement des MβLs) (Daiyasu et al., 2001); un domaine C-terminal muni d’une région hydrophobe présumée pour recruter les longs substrats aliphatiques ; enfin un domaine central de dimérisation présentant une résistance au SDS à de fortes concentrations. Le domaine catalytique de l’arylsulfatase SdsA1 adopte un repliement α/β/α commun à la famille des métallo-β-lactamases et lie deux ions zinc comme co-facteurs via des acides aminés histidines conservés (Davison et al., 1992 ; Hagelueken et al., 2006). La résolution des structures cristallines des protéines et des complexes enzyme-substrat, révèle un mécanisme enzymatique impliquant une molécule d’eau indirectement activée par le cluster Zn²⁺, distinguant de ce fait ces sulfatases des autres classes précédemment décrites (groupe I et II).

L’arylsulfatase AtsA de P. carrageenovora (souche 9) (Barbeyron et al., 1995) appartient à la famille des métallo-β-lactamases et présente les histidines conservées formant le site métallique binucléaire (Melino et al., 1998). Cependant, elle ne présente que 13% de similarité de séquence avec le domaine catalytique de l’alkysulfatase SdsA1 de P. aeruginosa, et utilise comme cofacteur des ions Mn²⁺. La structure cristalline de la protéine homologue de ElaC de Bacillus anthracis (Brunzelle et al., non publiée), une protéine homologue de l’AtsA de P. carrageenovora (souche 9), a été résolue (Figure IG-48), montrant le repliement caractéristique des β-lactamase. Ainsi, l’arylsulfatase AtsA de P. carrageenovora (souche 9) pourrait être le premier membre d’une sous-famille des sulfatases métallo-β-lacatamases.