1 Cinétiqueenzymatique

Après déacétylation, les composés sont systématiquement envoyés à l’équipe du Dr. Evangelia Chrysina à Athènes pour être évalués pour leur inhibition sur la GPb musculaire du lapin (RMGPb). Ce groupe travaille sur la glycogène phosphorylase depuis plus de 20 ans et possède un savoir faire important dans l’obtention, la purification et la cristallisation de cette enzyme. Les activités inhibitrices de nos composés sont regroupées par familles dans les

Graphique V-1 à Graphique V-4).

D’une manière générale, les spiro-isoxazolines 1 (Graphique V-1) sont de bons inhibiteurs de la GP et les nouvelles molécules de cette famille que nous avons testées

montrent des activités du même ordre de grandeur (μM) que celles déjà étudiées (Figure

V-1).^56,193

Figure V-1 : Spiro-isoxazolines précédemment étudiées

178

Les molécules substituées par des motifs bicycliques (1k-p) sont les plus actives mais

le composé 1h portant un groupement SMe en para du phényle montre lui aussi un IC₅₀

intéressant (5.6 μM), meilleur que celui du dérivé 1a portant un groupement méthoxy sur la

même position, probablement du fait de la capacité du soufre à former des liaisons hydrogène par l’intermédiaire de ses doublets d’électrons non liants ou bien par le biais d’interactions faibles permises par l’hydrophobie plus forte du soufre. L’introduction d’un substituant en position 6 du noyau 2-naphthyle n’apporte pas d’effet positif. Le dérivé 6-méthoxy-2-napththyle 1n (IC50 = 27.7 μM) est moins actif que le 2-naphthyle 1m ( Ki = 0.63 μM) et le

dérivé 6-hydroxy-2-naphthyle (IC50 = 1.54 μM) 1o a un IC50 équivalent. C’est très

certainement le caractère donneur de liaison hydrogène du composé 1o qui explique la différence d’inhibition avec l’analogue méthoxy 1n. La possibilité qu’ont ces deux composés à former de nouvelles liaisons hydrogène ne se traduit pas nettement en terme d’activité. Enfin, le composé 1p substitué par un résidu 9-phénanthrényle, qui peut être assimilé à un hybride entre un motif 1-naphthyle et 2-naphthyle, est moins actif (IC50 = 80.5 μM) que les dérivés bicycliques 1k-o ce qui suggère que ce groupement aromatique est trop encombrant et impose des changements conformationnels défavorables à l’intérieur du site catalytique. Ces points seront discutés par la suite dans le cadre des études cristallographiques.

Graphique V-1 : Activités inhibitrices des C-glucopyranosylidène-spiro-isoxazolines 324,7 81,3 80,5 27,7 13,2 _{5,6 1,54} 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 IC₅₀(μM)

Spiro isoxazolines

179

Par comparaison avec les IC50 déterminés pour les 1-(

-D-glucopyranosyl)-1,2,3-triazoles 4-substitués 5, les mesures faites sur les 5-halogéno-D-glucopyranosyl)-1,2,3-triazoles (Graphique V-2) montrent que l’introduction d’un halogène en position 5 du triazole est néfaste pour son activité inhibitrice. Les dérivés iodés 162a-e sont 5 fois moins actifs en moyenne que les 5-prototriazoles 5 correspondants et le dérivé 5-bromé 164b est 20 fois moins actif que son analogue non halogéné. L’analogue bromé 164a du composé 162a ne montre aucune activité inhibitrice aux concentrations testées. Enfin le composé 5-chloré 167a est 1.5 fois plus actif que son analogue iodé cependant, étant le seul de cette famille à avoir été testé, il est impossible d’en déduire une relation structure activité générale pour les dérivés chlorés qui dans tous les cas semblent être moins actifs que les 5-prototriazoles 5 correspondants.

Graphique V-2 : Activités inhibitrices des 5-proto et 5-halogéno-1,2,3-triazoles 4-substitués 162 849,4 54,5 ^102,8 1037 26 714,4 475,6 0 200 400 600 800 1000 1200 X=H X=I X=Br X=Cl IC₅₀(μM)

5 proto et 5 halogénotriazoles

180

Pour les 1-( -D-glucopyranosyl)-1,2,3-triazoles, la substitution en position 5 du noyau triazole par des groupements apolaires aromatiques (179c et 180ac), aliphatiques (202c) ou par un groupement polaire peu encombrant (180ca) a un effet négatif sur l’activité du composé (Graphique V-3). Ces résultats suggèrent que la zone de la poche catalytique située dans la direction par rapport au motif glucose n’est pas assez volumineuse pour accueillir un substituant. D’autres composés de cette famille n’ont pas encore été testés, notamment les molécules substituées par un éthylène ou un acétylène (180ad,cd) Un résultat est toutefois étonnant : les composés 180ca et 180ac montrent des activités similaires alors que les substituants du noyau triazole sont très diffèrents, ceci laisse à penser que le composé 180ac se lie dans le site actif de manière à orienter le motif 6-méthoxy-2-naphthyle vers le canal par le biais d’une rotation autour de la liaison C-1–N-1. Des études cristallographiques sont en cours pour confirmer ce phénomène qui confirmerait le manque d’espace libre dans la direction du site catalytique

Graphique V-3 : Activités inhibitrices des 1,2,3-triazoles 1,4,5-trisubstitués XX-XX 811 620 230 ₁₉₀ Ͳ100 100 300 500 700 900 1100 1300 1500 IC₅₀(μM)

Triazoles 1,4,5 trisubstitués

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A l’exception du spiro-oxathiazole 2b, qui appartient à la famille des inhibiteurs les plus efficaces,¹⁹⁴ les molécules des autres familles représentées sur le Graphique V-4, n’ont pas montré d’activités prometteuses. Dans le cas du bis-triazole 168c cela n’a rien de surprenant, sa structure étant radicalement différente des gluco-hétérocycles et gluco-spiro-hétérocycles habituellement testés contre la GP et sans complémentarité avec la structure du site actif. En ce qui concerne les alkylamino-1,2,4-oxadiazoles (le dérivé isopropylamino 4’a n’a montré aucune inhibition aux concentrations testées) et la spiro-oxazine 75, l’absence d’activité inhibitrice s’explique probablement par l’absence de groupement aromatique orienté vers le canal et permettant la stabilisation de l’inhibiteur à l’intérieur de la poche catalytique. Concernant les spirooxathiazoles qui montrent de bonnes inhibitions même dans le cas du composé 2b où le phénanthrène volumineux pourrait avoir un effet négatif, il est possible que la géométrie rigide particulière de ces composés permette à la fois une bonne insertion du résidu glucose au site actif mais aussi une orientation optimale de l’aglycone dans la poche . Les paramètres géométriques associés aux propriétés du soufre (hydrophobie, longueur de la liaison C–S) sont sans doute des facteurs qui contribuent d’une manière déterminante à l’activité de ces ligands.

Graphique V-4 : Activités inhibitrices des composés appartenant aux autres familles (5-alkylamino-1,2,4-oxadiazoles, bis-triazoles, spiro-oxazines et spiro-oxathiazoles)

1011 797 400 32 Ͳ100 100 300 500 700 900 1100 1300 1500 IC₅₀(μM)

Autres composés

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Une dernière famille de composés, dérivés du 5-thio- -D-xylose (Figure V-2), n’a

montré aucune activité inhibitrice aux concentrations testées (IC₅₀ > 1 mM). Cette absence d’activité provient en partie du manque de solubilité des composés déacétylés qui même dans le DMSO sont très peu solubles : l’équipe du Dr. Evangelia Chrysina nous a fait part de leurs difficultés à obtenir des solutions exploitables pour les tests enzymatiques. D’autre part, l’absence du groupement hydroxyméthyle en C-5 et donc l’incapacité des composés à interagir avec le résidu His377 du site catalytique, a très probablement un effet négatif sur la liaison du motif 5-thioxylopyranose au site de fixation du glucose comme cela est connu pour d’autres xylosides. L’espoir d’établir des interactions favorables soit au niveau des aglycones soit par oxydation du soufre endocyclique n’a pas été réalisé. En effet, aucune amélioration n’a été apportée par la présence d’un ou deux atome(s) d’oxygène sur l’atome de soufre endocyclique puisque les sulfoxydes et les sulfones testés n’ont pas montré non plus d’activité inhibitrice (IC50 > 1 mM).

Figure V-2 : Composés dérivé du 5-thio- -D-xylose ne possédant aucune activité inhibitrice

183

I.1 Etudes cristallographiques

La co-cristallisation de nos composés avec la GP est une technique maitrisée par l’équipe du Dr. Evangelia Chrysina en vue de l’étude par diffraction des rayons X sur des échantillons mono-cristallins à l’aide de rayonnement synchrotron disponible à l’EMBL d’Hambourg. Ces études permettent d’étudier le mode de liaison adopté par les inhibiteurs, les changements conformationnels de l’enzyme induits par la fixation d’un inhibiteur ainsi que les interactions mises en jeu entre l’inhibiteur et la protéine. Seuls les composés montrant les meilleures activités ont pu faire l’objet de ces études.

Des données ont été récoltées pour les nouvelles spiro-isoxazolines 1h, 1k, 1l et 1o et comparées avec les résultats obtenus pour la spiro-isoxazoline 1m substituée par le motif 2-naphthyle. La superposition des structures 3D montre que le mode de liaison dans le site de fixation du glucose reste le même (Figure V-3). Par contre, l’orientation du noyau isoxazoline ainsi que du groupement aromatique changent en fonction du substituant. Ces changements induisent des modifications conformationnelles au niveau de la structure tertiaire du site catalytique et plus particulièrement au niveau des résidus de la boucle 280s qui permet ou non le passage du glycogène vers le site actif (Figure V-4).

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Figure V-3 : Superposition des spiro-isoxazolines 1k, 1l, 1m, 1o et 1p liées au site catalytique de la RMGPb

Figure V-4 : Superposition des ligands 1k, 1l, 1m, 1o, 1p et des résidus du site actif de la RMGPb entourant le motif isoxazoline et son substituant aromatique

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L’introduction d’un groupement hydroxyle en position 6 du naphthyle (Figure V-5, IC₅₀ = 1.54 μM) conduit à un inhibiteur ayant une activité similaire à l’analogue 2-naphthyle non substitué. Les liaisons hydrogène supplémentaires formées entre l’hydroxyle et les résidus Asn282, Arg292 et Glu385 par le biais de deux molécules d’eau semblent insuffisantes pour compenser les altérations observées sur la chaîne latérale du résidu Asn282 (rotation de 60° et déplacement des atomes de 0.5 Å environ). Une molécule d’eau est déplacée pour éviter le contact avec l’atome d’azote de la chaine latérale du résidu Asn282. Cette dernière, dans sa nouvelle position, forme une liaison directe avec l’atome d’oxygène de la chaine principale du résidu Phe285 induisant de légers changements à la fois sur la chaine principale (atomes C et O) et les atomes de carbone du cycle phényle qui se déplacent de 0.5 Å environ.

Figure V-5 : Représentation schématique de la spiro-isoxazoline 1o liée au site actif de la RMGPb

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Le remplacement du noyau phényle externe du naphthyle par un noyau 1,4-dioxane (Figure V-6, IC₅₀ = 13.2 μM) facilite la formation directe de liaisons hydrogène entre les atomes d’oxygène du substituant et les résidus Asn282 et His341 respectivement. L’atome d’oxygène en position 4 du dioxane forme une liaison hydrogène supplémentaire relayée par une molécule d’eau avec l’atome d’oxygène du résidu Ala383 qui se rapproche alors légèrement du ligand (de 0.4 Å environ). L’introduction du motif 1,4-dioxane entraine une rotation du groupement aromatique de 20° environ autour de la liaison reliant l’isoxazoline au substituant 1,4-benzodioxanyle. L’inhibiteur se rapproche de la boucle 280s ce qui stabilise l’état T. Mais pour cela, les atomes des résidus Asn282 et Asn284 sont déplacés de ~0.4 à ~1.2 Å et de ~0.5 Å respectivement. Ces modifications dans la boucle 280s peuvent avoir un impact négatif et être responsable de la moins bonne activité comparé à l’inhibiteur 1m.

Figure V-6 : Représentation schématique de la spiro-isoxazoline 1l liée au site actif de la RMGPb

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Au contraire du composé 1l, les modifications induites par la fixation de 1k, portant un

noyau 1,3-benzodioxolane (Figure V-7, IC₅₀ = 81.3 μM), sont moins importantes. Tout

comme dans le cas du composé 1l, deux liaisons hydrogène supplémentaires sont formées avec les résidus His341 et Asn282. Une légère perturbation est observée sur le reste des résidus de la boucle 280s et particulièrement l’acide aminé Phe285 dont l’atome d’oxygène du carbonyle interagit avec l’atome d’oxygène O-1 du 1,3-dioxolane par le biais d’une molécule d’eau. Les modifications observées peuvent être attribuées au réarrangement du réseau de molécules d’eau du site catalytique. D’un point de vue global les structures des complexes RMGPb avec les composés 1k et 1l sont très similaires malgré la meilleure inhibition de 1l. Ceci pourrait s’expliquer par des liaisons hydrogène plus courtes entre les atomes d’oxygène du noyau 1,4-dioxane par rapport à celles formées dans le cas du motif 1,3-dioxolane.

Figure V-7 : Représentation schématique de la spiro-isoxazoline 1k liée au site actif de la RMGPb

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Le composé 1p, substitué par un motif 9-phénanthryle (Figure V-8), possède un IC₅₀

= 80.5 μM. La structure cristalline révèle qu’en se liant au site actif de la GP, les résidus de la boucle 280s s’écartent fortement de leur position initiale pour former un espace suffisant à l’intérieur du canal et permettre l’insertion du noyau 9-Phénanthrényle (Figure V-9). Ces modifications importantes sont le plus visibles sur les résidus Asn282, Asp283, Asn284 et Phe285. Plus précisément, les atomes des chaines principales des résidus bordant la boucle sont déplacés de ~1.1 Å à ~6.6 Å. La chaine latérale du résidu Asn284, en particulier, s’oriente de manière à éviter la contrainte stérique avec le noyau phénanthrène et se trouve, dans sa nouvelle position, intercalée entre les résidus Phe285 et Tyr613, dénaturant ainsi le site inhibiteur de la GP situé au voisinage du site catalytique. Le résidu Phe285 change alors

de conformation par rotation de ses deux angles dièdres (Ȥ1, Ȥ2) de (~40°, ~163°)

respectivement. Une analyse plus approfondie des changements induits par la présence du 9-phénanthryle est actuellement en cours.

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Figure V-8 : Représentation schématique de la spiro-isoxazoline 1p liée au site actif de la RMGPb

Figure V-9 : Représentation schématique alternative de la spiro-isoxazoline 1p liée au site actif de la RMGPb selon un plan parallèle au noyau phénanthrène

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