Cell surface protein A (CspA)

CspA (Cell surface protein A) est une protéine pariétale glycosylée de masse moléculaire de 75 kDa ancrée par une ancre GPI pouvant être extraite par un traitement à l’acide hydrofluorique. CspA est démasquée pendant la germination de la conidie et est exprimée pendant la croissance hyphale. La délétion du gène entraîne une germination plus rapide et une diminution de l’adhérence des conidies dormantes à la matrice extracellulaire de cellules pulmonaires murines. La paroi du mutant δcspA est aussi moins épaisse. Sa surexpression augmente la résistance de la conidie aux enzymes de dégradation et inhibe sa germination. Il a été montré que CspA interagissait avec Ecm33p et Gel2p. Les doubles mutants δCspAδEcm33 ou δCspAδgel2 entraînent une désorganisation de la paroi conidiale menant à l’exposition des couches sous-jacentes de β-glucane et de chitine. Par marquage avec des lectines-FITC puis analyse par cytométrie en flux, il a été observé que les quantités de chitine, glucane et de mannanes augmentaient chez ces doubles mutants par rapport à une souche WT. CspA est nécessaire au maintien d’une architecture correcte de la paroi. Trois autres gènes codant des CWP (Cell Wall Protein)-GPI potentielles : AFUA_2G05150 (MP-2) ; AFUA_4G09600 et AFUA_6G14090 pourraient aussi être impliqués dans le maintien de cette intégrité pariétale (Ledvansky E. et al., 2010).

Contexte du travail de thèse

Les infections fongiques invasives forment aujourd’hui un des groupes de pathologies infectieuses les plus graves en santé humaine. Les deux espèces les plus représentées chez les patients immunodéprimés dans nos pays industrialisés sont Candida albicans et Aspergillus fumigatus. La mortalité due aux mycoses invasives causées par ces deux champignons est en constante augmentation. Leur morbidité entraîne des prolongations de séjour hospitalier et le coût des traitements antifongiques croît régulièrement dans tous les hôpitaux européens et nord-américains. Depuis plus de 10 ans maintenant, A. fumigatus est la cause d’un nombre croissant de décès à l’hôpital. Cette situation est associée à l’augmentation du nombre des patients à risque consécutivement :

(1) au développement de chimiothérapies de plus en plus drastiques pour combattre les cancers, (2) à l’augmentation du nombre de transplantations d’organes (évalué à 500 000 par an dans le monde),

(3) à l’utilisation croissante de traitements immunosuppresseurs pour traiter les maladies auto- immunes et (4) à la persistance d’infections au VIH.

La paroi du champignon qui est essentiellement constituée de polysaccharides et de protéines est le lieu privilégié des échanges entre la cellule et l’hôte. Elle est indispensable à l’intégrité de la cellule fongique en jouant un rôle essentiel dans la résistance aux agressions externes et en particulier aux défenses des cellules immunitaires de l’hôte. L’étude de la paroi ou des mécanismes qui participent à son élaboration fait donc aujourd’hui l’objet de nombreuses études fondamentales et appliquées. La biosynthèse de la paroi est un processus biochimique extrêmement complexe. Contrairement à une opinion généralement admise jusqu'à ce jour, elle ne doit plus être considérée comme un squelette inerte mais plutôt comme une organelle dont la composition et la localisation des polymères constitutifs varient aux différents stades du cycle biologique (Bernard et Latgé, 2001 ; Latgé, 2010). Seules des approches globales et multidisciplinaires permettront de mieux appréhendrer l'ancrage et l'établissement du réseau tridimensionnel polysaccharidique extrêmement complexe de la paroi. Le partenariat Sanofi-Aventis-Aviesan s'est entendu pour focaliser sa recherche sur les étapes précoces de l'infection. Le processus de germination de la conidie, une étape incontournable dans le développement du pathogène, sera étudié avec emphase sur l’étude de la paroi cellulaire qui est spécifique aux champignons et reste un réservoir de cibles pour des agents antifongiques.

Nous avons également étudié un second pathogène des voies respiratoires, P. aeruginosa, que l’on retrouve particulièrement chez les individus atteints de mucoviscidose. Ces bactéries interagissent avec des motifs glycanniques du mucus pulmonaire permettant ainsi leur adhésion et la formation de biofilm. L’objectif de ce deuxième travail consiste à determiner s’il existe des ligands préférentiels favorisant l’adhésion des bactéries chez ces individus malades. Cela permettra à terme la synthèse de glycomimétiques empêchant cette adhésion.

I. Préparation des parois des conidies dormantes, gonflées et germées ainsi que des mutants d’Aspergillus fumigatus

Après lyophilisation, 100 mg de parois lyophilisées sont traitées par 15 ml d’un tampon composé de Tris-HCl 100 mM pH7,4, d’EDTA 50 mM, de SDS 2% et de β-mercaptoéthanol 40 mM. Ce mélange est incubé 10 min à 100°C puis refroidi avant d’être centrifugé à 4°C pendant 10 min à 10.000g. Le surnageant 1 est conservé. Le culot subit une deuxième fois ce traitement puis les surnageants 1 et 2 sont rassemblés. Le culot est ensuite lavé trois fois dans ce même tampon sans SDS et sans β- mercaptoéthanol puis collecté par centrifugation à 4°C pendant 10 min à 10.000g. Ce traitement est suivi par trois lavages avec l’eau distillée. Le culot est lyophilisé puis pesé avant de préparer les fractions alcalino-insolubles (AI) et –soluble (AS).

Pour la préparation des fractions AI et AS, le culot subit deux fois le même traitement alcalin. Pour 75 mg de parois résiduelles, 4 ml de NaOH 1 M contenant 500 mM de NaBH4 sont ajoutés au culot puis le mélange est incubé 30 min à 65°C et refroidi sur glace avant centrifugation à 4°C pendant 15 min. Les deux surnageants correspondant à la fraction AS sont rassemblés et neutralisés avec de l’acide acétique puis sont dialysés contre H2O dans des boudins de dialyse avec un seuil de coupure de 1000 Da. A la fin de la dialyse, la fraction AS est centrifugée et le culot lyophilisé puis pesé. Concernant la fraction AI, elle est lavée à l’eau distillée jusqu’à obtention d’un pH neutre et est également lyophilisée puis pesée.

II. Production de LamA (endo-β1,3-glucanase de Thermogota neapolitana) pour la