Spécialité : Horticulture
Option : Gestion Durable du Végétal en Horticulture et Aménagements Paysagers
Par : Florian BRYONE
Annexes
JURY
Président : Jean-Charles Michel
Maîtres de stage : Christel Leyronas, Philippe Nicot Tutrice : Stéphanie Godet
Enseignant responsable de l’option : Jean-Charles Michel
Autres membres du jury : Marc Bardin, Bruno Le Cam, Christophe Le May Centre d’Angers - Institut National
d’Horticulture et de Paysage
2, rue André Le Nôtre 49045 ANGERS Cedex 01
Tél : 02 41 22 54 54
INRA PACA – Unité de Recherche 407 Pathologie Végétale
Domaine Saint-Maurice 84143 Monfavet Tél : 04 32 72 28 43
"Les analyses et les conclusions de ce travail d'étudiant n'engagent
que la responsabilité de son auteur et non celle d’AGROCAMPUS OUEST".
Diplôme d’Ingénieur de l’Institut Supérieur des Sciences
Agronomiques, Agroalimentaires, Horticoles et du Paysage
Caractérisation de populations de Botrytis cinerea issues de
cultures de laitues et de tomates sous abris
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Annexe I Protocole d’extraction d’ADN (Frozen plant tissue DNeasy 96 Qiagen)
Au préalable: Mettre le bain marie et l’étuve en marche.
Préparer le mélange : 90ml AP1 + 225µl Rnase + 225µl reagent DX. Mettre dans le bain marie à 65°C (RNase stockée au frigo).
1- Mettre 400µl de tampon (AP1+ RNase + reagent DX) dans chaque tube (avec une bille de Tungsten). Boucher les plaques avec leurs barrettes précédentes.
2- Secouer 2 x 2 minutes avec la « machine à secouer » (30hz). Prendre les éléments en inox, enlever les couvercles des plaques d’extraction.
3- Incuber 65°C pendant 15 minutes dans l’étuve.
4- Secouer 15 secondes à la main puis centrifuger à 3000 rpm.
5- Ajouter 130µl de tampon AP2 + boucher avec nouveau tapis (ne pas jeter le précédent, le laver).
6- Secouer 15 secondes à la main puis centrifuger à 3000 rpm. 7- Incuber 10 minutes à -20°C.
8- Centrifuger 10 minutes à 4600 rpm.
9- Pipeter 400 μl de surnageant et le transférer dans une nouvelle plaque (boite bleue identique à la première).
10-Ajouter 600 μl de tampon AP3. Fermer avec un nouveau tapis. 11- Secouer 15 secondes puis centrifuger à 3000 rpm.
12- Transférer 1ml vers la plaque à filtre (rouge). Placer une plaque poubelle en dessous (non fournie dans le kit).
13- Fermer avec « airpore tapsheet » puis centrifuger 10 minutes à 4600 rpm. 14- Ajouter 800 µl de tampon AW puis refermer avec « airpore tapsheet ». 15 Centrifuger 20 minutes à 4600 rpm.
16- Placer la plaque à filtre sur une plaque à élution.
17- Ajouter 50 μl de tampon AE et recouvrir d’un « airpore tapsheet ». Laisser 1 minute à température ambiante. Centrifuger 4 minutes à 4600 rpm.
18- Recommencer l’étape 17.
19- Fermer les plaques avec des barrettes de bouchons en plastique puis mettre au congélateur (-20°C)
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Annexe II Exemple de profils haplotypiques obtenus après génotypage de souches de B. cinerea
Taille des 9 microsatellites (en paire de bases) Nom de souche MS1 MS2 MS5 MS9 MS10 MS 3 MS4 MS6 MS7 153_LT8 250 167 154 147 176 222 128 134 116 135_LT8 238 161 160 151 184 220 119 126 124 136_LT8 238 145 160 151 184 222 119 126 124 142_LT8 238 163 160 151 188 222 119 126 124 144_LT8 238 163 160 151 188 222 119 126 124 146_LT8 238 171 154 151 184 224 119 126 126 148_LT8 234 149 160 151 184 222 119 122 120 151_LT8 234 163 160 151 188 222 119 126 126 152_LT8 238 165 166 151 184 224 119 126 116 157_LT8 220 165 150 151 182 222 128 122 116 158_LT8 238 161 160 151 172 222 119 126 126 159_LT8 238 161 160 151 172 222 119 126 126 164_LT8 220 165 150 151 182 222 128 122 116 168_LT8 234 171 162 151 186 222 128 122 124 173_LT8 234 161 160 151 188 220 128 126 116 171_LT8 258 151 152 153 174 218 131 166 124 165_LT8 246 161 156 155 166 216 128 132 126 137_LT8 232 153 174 147 178 218 128 130 118
Centre d’Angers
Institut National d’Horticulture et du paysage
Spécialité : Horticulture
Option : Gestion Durable du Végétal en Horticulture et Aménagements Paysagers Enseignant responsable de l’option : Jean-Charles Michel
Tutrice : Stéphanie Godet
Auteur(s) : Florian Bryone Organisme d'accueil : INRA PACA
Adresse : Unité de Recherche 407 Pathologie Végétale Domaine Saint-Maurice
84143 Monfavet
Maîtres de stage : Christel Leyronas, Philippe Nicot Nb pages : 46 Annexes : 2
Année de soutenance : 2011
Titre : Caractérisation de populations de Botrytis cinerea issues de cultures de laitues et de tomates sous abris.
Résumé :
Des souches de Botrytis cinerea, prélevées sous abris dans le sol ainsi que sur des laitues et des tomates, ont été génotypées à l’aide de 9 marqueurs microsatellites. Sur la base d’indices standards de la génétique des populations, les différents types d’inoculum ont été caractérisés en vue de répondre aux problématiques suivantes : (i) B. cinerea présente-t-il une spécificité d’hôte ? (ii) L’inoculum se transmet-il sur des cultures successives de laitues d’un même tunnel ? (iii) L’inoculum infectant des laitues est-il disséminé d’un tunnel à un autre ? (iv) Existe-t-il des flux d’isolats entre les compartiments sol et plante ? La caractérisation génétique de souches issues de laitue et de tomate a indiqué qu’une spécificité d’hôtes pouvait exister. La réalisation de tests d’agressivité a permis d’appuyer ce résultat. Les indices de génétique ont montré que l’inoculum endogène d’un tunnel pouvait être transmis d’une culture à une autre. Concernant le transfert de l’inoculum d’un tunnel à l’autre, bien qu’elle ait été envisagée possible, il semble qu’elle n’ait pas été abondante dans le cadre de cette étude. Dans les deux cas, l’introduction régulière d’inoculum exogène a été proposée. Enfin, l’existence de flux d’isolats entre les compartiments sol et plante a été démontré, notamment des plantes vers le sol. Sur la base de ces résultats, des propositions ont été faites en termes de pratiques culturales pour limiter l’impact de B. cinerea.
Abstract :
Botrytis cinerea strains, isolated from soil, lettuce and tomato, have been genotyped with nine microsatellites. From basic
population genetic parameters, different types of inoculum have been characterized in order to answer to the following questions: (i) Does B. cinerea show host specificity? (ii) Is the inoculum passed on successive lettuce crops in a same tunnel? (iii) Is the lettuce infecting inoculum transferred from a tunnel to another one? (iv) Do isolates flows exist between soil and plant compartments? Genetic characterization of strains isolated from lettuce and tomato indicated that host specificity was likely. Pathogenic tests supported this finding. Endogenic inoculum transmission between successive crops has been suggested. Although inoculum transfer has been considered possible between tunnels, it was not abundant. In both last cases, regular introduction of exogenic inoculum has been put forward. Finally, existence of isolates flows between soil and plants has been showed, especially from plants to soil. From these findings, proposals in terms of cultural practices have been made to reduce the impact of B. cinerea.
Mots-clés : Botrytis cinerea, marqueurs microsatellites, caractérisation, génétique des populations, agressivité Key words : Botrytis cinerea, microsatellite markers, characterization, population genetics, pathogenicity