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Caractérisation de populations de B. cinerea issues de
cultures de laitues et de tomates sous abris
Florian Bryone
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Florian Bryone. Caractérisation de populations de B. cinerea issues de cultures de laitues et de tomates sous abris. Sciences du Vivant [q-bio]. 2011. �hal-02804512�
Caractérisation de populations de Botrytis cinerea issues de cultures de laitues et de tomates sous abris de BRYONE Florian est mis à disposition selon les termes de la licence Creative Commons Paternité - Pas d’Utilisation Commerciale - Pas de Modification 2.0 France.
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Mémoire de Fin d'Etudes
Diplôme d’Ingénieur de l’Institut Supérieur des Sciences
Agronomiques, Agroalimentaires, Horticoles et du Paysage
Spécialité : HorticultureOption : Gestion Durable du Végétal en Horticulture et Aménagements Paysagers
Caractérisation de populations de Botrytis cinerea issues de
cultures de laitues et de tomates sous abris
Par : Florian BRYONE
Soutenu à Angers, le 13 septembre 2011
JURY
Président : Jean-Charles Michel
Maîtres de stage : Christel Leyronas, Philippe Nicot
Tutrice : Stéphanie Godet
Enseignant responsable de l’option : Jean-Charles Michel
Autres membres du jury : Marc Bardin, Bruno Le Cam, Christophe Le May
"Les analyses et les conclusions de ce travail d'étudiant n'engagent que la responsabilité de son auteur et non celle
Diffusion du mémoire
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Angers, le
Le Maître de stage(2), L’auteur,
L’Enseignant responsable d’option(2)
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(1) L’administration, les enseignants et les différents services de documentation du Centre d’Angers d’AGROCAMPUS OUEST s’engagent à respecter cette confidentialité.
Remerciements
Je tiens à remercier :
Cindy Morris, directrice de l’unité Pathologie Végétale, pour sa confiance et pour m’avoir permis de réaliser mon stage de fin d’étude au sein de l’INRA d’Avignon.
Christel Leyronas, ma maître de stage, pour son encadrement, son professionnalisme, pour les séances de relecture et les nombreux conseils donnés. Un grand merci pour l’ouverture musicale apportée, mais surtout pour ta gentillesse et ta bonne humeur, ça a été un réel plaisir de travailler avec toi.
Philippe Nicot, co-encadrant de ce stage, pour ses conseils avisés et pour le temps passé à corriger et relire ce mémoire.
Magali Duffaud, technicienne de laboratoire, pour son aide précieuse apportée durant les manipes.
L’équipe Culture de l’unité Pathologie Végétale, pour toutes les plantes produites, nécessaires à la réalisation de mes tests.
Anne Roig, ingénieur d’études à l’URFM, pour être venue à notre rescousse lorsque le séquenceur capillaires n’en faisait qu’à sa tête.
Lilian Gout, enseignant-chercheur à l’unité BIOGER-CPP d’Agro Paris Tech, pour m’avoir aiguillé dans le vaste domaine de la génétique des populations.
Morgane, pour m’avoir soutenu dans les périodes de stress et pour tous ces bons moments passés en Avignon. Ca y est, on y est arrivé !!!
Manzoor, thésard, avec qui j’ai pu travailler l’année dernière lors d’un précédent stage. Merci pour ta gentillesse, ta simplicité et ces moments passés à discuter. Je te souhaite bonne chance pour la suite !
Hélène, pour son écoute, sa malice et ses nombreuses blagues qui m’ont bien fait rire. Je suis content d’avoir fait ta connaissance, surtout ne change rien !
Caroline, Greg, Hanna, Inès, Jimmy, Julie, Ludovic, Magali et Morgane, sans qui ce stage n’aurait pas été le même ! Merci pour tous ces bons moments passés à la cantine, aux Négociants, au McDo, à SushiShop, chez Ginette et Marcel (Bistrot à tartines, place des Corps Saints, excellente adresse) et sous le Pont du Gard en canoë. Prenez soin de vous et à très bientôt, j’espère.
Plus généralement, un grand merci à toutes les personnes qui ont contribué à rendre l’unité de Pathologie Végétale si sympathique durant mon stage.
Table des matières
Introduction 1
Synthèse Bibliographique
I. Présentation générale de Botrytis cinerea 3
1. Taxonomie et structure génétique 3
2. Spectre d’hôtes et importance économique 3
3. Symptômes 3
4. Cycle de vie et épidémiologie 4
II. Laitues et tomates, des cultures particulièrement affectées par Botrytis cinerea 5
1. La laitue 5
a) Importance économique 5
b) Botrytis cinerea – conditions de développement et principaux symptômes 5
2. La tomate 6
a) Importance économique 6
b) Botrytis cinerea – conditions de développement et principaux symptômes 6
3. Stratégies de lutte en culture de tomates et laitues 7
a) Lutte chimique 7
b) Lutte biologique 7
c) Mesures prophylactiques 8
III. Intérêt de l’étude de la structure génétique des populations 9
1. Efficacité limitée des méthodes de lutte existant 9
2. Informations apportées par la génétique des populations 9 3. Les marqueurs microsatellites : des outils moléculaires performants 9 IV. Problématiques de l’étude : état actuel des connaissances 10
1. Botrytis cinerea présente-t-il une spécificité d’hôte ? 10 2. L’inoculum de Botrytis cinerea se transmet-il sur des cultures successives
d’un même tunnel ? 11
3. L’inoculum de Botrytis cinerea est-il disséminé d’un tunnel à un autre ? 11 4. Existe-t-il des flux d’isolats entre les compartiments sol et plante ? 12 Matériel et Méthodes
I. Contexte expérimental 13
1. Sites d’expérimentation 13
2. Cultures et itinéraires techniques 13
II. Collecte des isolats 15
1. Prélèvements d’isolats de Botrytis cinerea sur plantes 15 2. Isolement de souches de Botrytis cinerea à partir d’échantillons de sol 15
III. Traitement des isolats 15
1. Purification des isolats 15
2. Stockage et lyophilisation des isolats monosporés 16
IV. Caractérisation génotypique 16
1. Extraction de l’ADN 16
2. Amplification de séquences microsatellites par PCR multiplex 16
4. Détermination des tailles d’allèles 17
V. Analyse de génétique des populations 17
1. Caractérisation de la diversité intra-population 17
2. Détermination du déséquilibre de liaison 18
3. Estimation de la différenciation inter-population 18
4. Structure génétique des populations 18
VI. Caractérisation phénotypique : tests d’agressivité 19
1. Choix des souches 19
2. Production du matériel végétal 19
3. Test sur tomates 19
4. Test sur pommes 20
5. Test sur laitues 21
6. Analyse statistique 21
Résultats
I. Botrytis cinerea présente-t-il une spécificité d’hôte ? 23
1. Caractérisation génétique 23
2. Caractérisation phénotypique : tests d’agressivité 24
a) Test sur tomates 24
b) Test sur laitues 25
c) Test sur pommes 26
II. L’inoculum de Botrytis cinerea se transmet-il sur des cultures de laitues
successives ? 26
III. L’inoculum de Botrytis cinerea se transmet-il entre tunnels proches ? 28 IV. Existe-t-il des flux d’isolats de Botrytis cinerea entre les compartiments
sol et plante ? 31
Discussion
I. Botrytis cinerea présente-t-il une spécificité d’hôte ? 33 II. L’inoculum de Botrytis cinerea se transmet-il sur des cultures de laitues
successives ? 35
III. L’inoculum de Botrytis cinerea se transmet-il entre tunnels proches ? 36 IV. Existe-t-il des flux d’isolats de Botrytis cinerea entre les compartiments
sol et plante ? 37
Conclusion 38
Références bibliographiques 40
Glossaire
Agressivité : Pouvoir pathogène d’un parasite défini par rapport à la résistance horizontale de
variétés de l’hôte.
Amorce : Oligonucléotide qui, hybridé avec une matrice d’acide nucléique, permet à une
enzyme polymérase d’initier la synthèse du brin complémentaire.
Appressorium : Organe de fixation et de pénétration des champignons dans les plantes. Asque : Cellule spécialisée chez les Ascomycètes à l’intérieur de laquelle se forment les
spores sexuées.
Clone : Ensemble de la descendance asexuée d’un génotype déterminé.
Electrophorèse : Technique permettant de séparer des molécules en fonction de leur taille
(ou poids moléculaire) en les faisant migrer à travers un gel par application d'un champ électrique. Plus la taille des molécules est faible, plus loin elles migrent sur le gel.
Fluorochrome : Substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après
excitation.
Fonte de semis : Destruction de plantules en germination par un parasite (habituellement
fongique).
Génotype : Ensemble ou partie de la composition génétique d’un individu.
Haplotype : Génotype d’un organisme haploïde. Dans la présente étude, il s’agit de
l’ensemble des tailles d’allèle des microsatellites pour un individu (haploïde).
Hyphe : Filament tubulaire (ramifié ou non) constituant l’appareil végétatif filamenteux des
champignons.
Inoculum : Terme générique qui désigne tout élément d’un parasite capable d’infecter l’hôte. Isolat : Matériel biologique prélevé sur un organisme vivant, en vue de son étude ou de sa
culture in vitro.
Mycélium : Partie végétative des champignons composé d’un ensemble de filaments.
Phénotype : Aspect observable d’un organisme déterminé par son génotype et
l’environnement.
Phytopathogène : Qui cause une maladie chez les plantes.
Plante hôte : Espèce de plante dont le développement d’un organisme dépend (source
nutritive).
Liste des abréviations
ACP: Analyse en Composantes Principales ADN : Acide DésoxyriboNucléique
AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphisms ARN : Acide RiboNucléique
AUDPC : Area Under the Disease Progress Curves BET : Bromure d’EThidium
BSTM : Botrytis Spore Trap Medium
dNTP : désoxyrioboNucléotide Tri-Phosphate GML: Génotype MultiLocus
PCR: Polymerase Chain Reaction PDA : Potato Dextrose Agar
RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphisms SSR : Simple Sequence Repeats
1 Jusque dans les années 90, l’utilisation de traitements phytosanitaires semblait incontournable. Il a été estimé que sans une gestion des adventices, des maladies et des ravageurs, les plantes cultivées subiraient en moyenne entre 20 et 40 % de pertes avant récolte et que plus de 10 % des denrées stockées disparaîtraient encore par la suite (Silvy, 1995). En vue d’éradiquer le problème des organismes nuisibles et d’assurer des rendements toujours plus importants, l’agriculture française a conçu des systèmes de cultures dits intensifs utilisant massivement engrais et produits phytosanitaires. La France est ainsi devenue le quatrième consommateur mondial et le premier européen en produits phytosanitaires, rendant son agriculture totalement dépendante de ces intrants. Aujourd’hui, les effets indésirables sur l’environnement et la santé humaine ont été mis en évidence à travers de nombreuses études scientifiques et sont largement pointés du doigt par la société.
A la suite du Grenelle de l’environnement, l’agriculture française s’est engagée en 2008 à réduire de 50% l’usage des pesticides dans un délai de 10 ans, si possible. Cette mesure, connue sous le nom de plan Ecophyto 2018, a notamment pour objectif de réduire la dépendance des exploitations agricoles aux produits phytosanitaires, tout en conservant un niveau élevé de production agricole, en quantité et en qualité (Source : agriculture.gouv.fr). Le projet SYSBIOTEL (Gestion intégrée des bioagresseurs telluriques en systèmes de culture légumiers), financé par l’Agence Nationale de la Recherche, a été conçu pour répondre aux attentes du Grenelle, avec pour objectif d’identifier des systèmes de production réduisant de moitié l’usage des pesticides. Interdisciplinaire, ce projet regroupe un ensemble d’études complémentaires telles que la recherche de systèmes innovants, identifiés comme alternatifs aux pesticides ou encore la mise au point de modèles épidémiologiques simulant l’impact de mécanismes de contrôle sur des maladies telluriques.
Dans le cadre du projet SYSBIOTEL, l’unité de recherche de Pathologie Végétale de l’INRA d’Avignon, avec l’appui du domaine expérimental d’Alénya Roussillon, étudie l'intérêt de méthodes de protection alternatives à la lutte chimique contre les maladies des cultures maraîchères sous abris. Une des cibles de cette étude est le champignon phytopathogène Botrytis cinerea, qui attaque notamment les cultures de tomates et de salades sous serres, sur lesquelles il entraine des diminutions de rendement et de qualité.
Dans le cadre de ce stage, des isolats de B. cinerea - collectés entre 2006 et 2010 dans le sol et sur des plants de laitue et de tomate – ont été génotypés à l’aide de neuf marqueurs microsatellites. Les différents types d’inoculum ont été caractérisés sur la base d’indices standards de la génétique des populations afin de répondre aux questions suivantes :
- B. cinerea présente-t-il une spécificité d’hôte ? Des souches présentes sur des laitues peuvent-elles infecter des plants de tomate et vice-versa?
- L’inoculum de B. cinerea se transmet-il sur des cultures successives de laitues dans un même tunnel ?
- L’inoculum de B. cinerea infectant des laitues est-il disséminé d’un tunnel à un autre ? - Existe-t-il des flux d’isolats entre les compartiments sol et plante ?
2 Concernant la recherche d’une spécificité d’hôte chez B. cinerea, la caractérisation génétique des populations étudiées a été complétée par la caractérisation phénotypique de certaines souches issues de tomates et de laitues. Des tests d’agressivité ont été réalisés sur ces deux plantes hôtes afin de déterminer si les souches inoculées présentaient une différence d’agressivité selon leur plante hôte d’origine.
Ce mémoire débute par une synthèse bibliographique présentant le champignon B. cinerea et les cultures hôtes, tomate et laitue. Elle décrit ensuite les méthodes de luttes actuellement disponibles et leur efficacité contre cet agent pathogène ainsi que les informations livrées par la génétique des populations et notamment par les marqueurs microsatellites, en vue d’élaborer de meilleures stratégies de lutte. Enfin, l’état actuel des connaissances disponibles sur les questions de recherches mentionnées précédemment est exposé. Dans une seconde partie, les moyens et les procédures utilisées dans le cadre de ce stage sont décrits de façon exhaustive. Les résultats obtenus sont ensuite présentés et discutés dans une quatrième partie. En conclusion, sur la base des résultats de cette étude, des propositions sont faites en termes de pratiques culturales pour limiter l’impact de B. cinerea.
SYNTHESE
3
I. Présentation générale de Botrytis cinerea 1. Taxonomie et structure génétique
Botrytis cinerea Pers. Fr. est un champignon phytopathogène nécrotrophe attaquant principalement les parties aériennes des plantes hôtes (Williamson et al., 2007). De la classe des Deuteromycètes, il appartient à l’ordre des Moniliales, famille des Moniliacées. Il possède une forme parfaite (téléomorphe), Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel, appartenant à la classe des Ascomycètes et à l’ordre des Léotiales, famille des Sclerotiniacées (Agrios, 2005). B. cinerea a longtemps été considéré comme une espèce clonale en raison de sa production importante de spores asexuées et de la rareté des structures sexuées en conditions naturelles (Váczy et al., 2008). Des études de populations réalisées en France ont démontré qu’en réalité, ce champignon présente une variabilité génétique importante et qu’il est composé d’un complexe d’espèces rassemblées dans deux grands groupes génétiques (Giraud et al., 1997 ; 1999) Le groupe I est constitué de souches « pseudo- cinerea » caractérisées par une résistance naturelle au fenhexamide (substance active présente chez certains fongicides) et par l’absence d’éléments transposables (Boty et Flipper). Tandis que le groupe II, composé de souches dites « cinerea stricto sensu » est sensible au fenhexamide et est divisé en deux sous-populations contenant soit les éléments transposable Boty et Flipper (type « Transposa ») ou non (type « Vacuma »). Il présenterait également une gamme d’hôtes plus importante et une distribution géographique plus large que le groupe I (Fournier et Giraud, 2008).
2. Spectre d’hôtes et importance économique
Plus communément appelé agent de la pourriture grise, ce champignon attaque à travers le monde un nombre considérable de cultures fruitières, légumières et ornementales (O’Neil et al., 1997; Shtienberg et al., 1998), aussi bien en plein champ et sous serre qu’après récolte, durant le stockage et le transport des produits (Fukumori et al., 2004). Particulièrement destructeur sur les plantes dicotylédones, légumes et petits fruits sont les plus sévèrement affectés. Il est par exemple considéré dans le monde comme un problème phytosanitaire majeur en viticulture (Martinez et al., 2005). Dans l’hémisphère nord, la culture de plantes hors saison, sous serres et sous tunnels plastiques, afin de produire davantage de fruits, de légumes, d’herbes et de fleurs, a considérablement augmenté le risque d’infection, notamment chez la tomate, le concombre et le poivron (Williamson et al., 2007). Dans les cultures fruitières, il serait responsable de pertes économiques considérables s’élevant à environ deux milliards de dollars par an (Valdès-Gómez et al., 2008). Avec l’essor du commerce international couplé à sa capacité à pouvoir se développer efficacement à des températures proches de 0°C, Botrytis cinerea est devenu également un problème d’une grande importance pour les denrées stockées tels les kiwis, les pommes et les poires. De la même façon, l’important commerce des fleurs coupées est très touché par ce agent pathogène et tout particulièrement les fleurs de rose et de gerbera (Williamson et al., 2007).
3. Symptômes
Les symptômes, observables sur fleurs, fruits, feuilles et tiges, se traduisent généralement par un pourrissement des tissus infectés, suivi par l’apparition d’un feutrage gris dû à une production importante spores (Williamson et al., 2007). Pour de nombreux fruits et légumes, l’infection débute habituellement sur des fleurs sénescentes puis la pourriture se propage jusqu’à atteindre les fruits adjacents en formation, comme c’est le cas chez les courgettes, les concombres, les haricots verts, les fraises et les pommes. Sur les pétales de fleurs, les
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Figure 2 Observation sous microscope de conidiophores de Botrytis cinerea, portant à leurs extrémités des conidies. Source : INRA
Figure 1 Sclérotes de Botrytis cinerea observés sur milieu PDA, en conditions de laboratoire. Source : INRA
4 symptômes varient de petites tâches à une décomposition généralisée, selon les conditions environnementales (Williamson et al., 2007). B. cinerea peut être également responsable de fonte des semis, principalement chez les cultures sous abris. Les tiges sont aussi la cible de lésions brunâtres appelées chancres. Le champignon se développe à l’intérieur de la tige, qui s’affaiblit et dans les cas les plus sévères, s’affaisse au niveau du point d’infection provoquant la mort de la plante. En conditions humides, les chancres sont recouverts d’un duvet mycélien sporulant (Agrios, 2005). Ainsi, les symptômes occasionnés sur de nombreux organes et plantes différents suggèrent que B. cinerea possède un arsenal d’armes très complet pour attaquer ses plantes hôtes (Choquer et al., 2007).
4. Cycle de vie et épidémiologie
Botrytis passe l’hiver dans le sol et dans des débris de culture sous la forme de mycélium ou de sclérotes. Ces petits organes noirs, durs et de forme irrégulière (Figure 1), sont considérés comme étant le principal moyen de survie à long terme du champignon (Amselem et al., 2011). Au printemps, les sclérotes germent et produisent des conidiophores (Figure 2). Il s’agit d’organes spécifiques portant à leur extrémité des conidies (ou macro-conidies), spores asexuées multinuclées et considérées chez Botrytis comme étant l’inoculum principalement produit et dispersé (Holz et al., 2003). En début de matinée, une diminution rapide de l’humidité couplée à une augmentation de température entraine une torsion et un dessèchement des conidiophores qui éjectent alors les conidies dans l’air. Les gouttes d’eau peuvent également jouer un rôle dans la dispersion des conidies mais plus rarement (Williamson et al., 2007), de même que les insectes (Holz et al., 2004). Leur adhésion et germination à la surface d’une plante hôte sont des étapes essentielles qui précèdent la pénétration et la colonisation des tissus (Doehlemann et al., 2006). Leur durée de vie au champ est faible et dépend de conditions abiotiques et biotiques telles que la température, l’humidité, l’exposition à la lumière ou encore l’activité microbienne (Elad et al., 2004). Lorsque les conditions environnementales sont particulièrement défavorables au champignon, un autre type de spores est produit, les micro-conidies. Elles interviennent dans le processus de reproduction sexuée en permettant la fécondation des sclérotes. Suite à une exposition prolongée au froid, les sclérotes fécondées produisent des structures sexuées nommées apothécies (Messiaen et al., 1991). Ces organes de fructifications libèrent par la suite des asques comprenant huit ascospores binucléées (Williamson et al., 2007). Toutefois, l’existence de ces apothécies au champ n’a été que très rarement observée (Martinez et al., 2008). La reproduction sexuée a surtout été observée en laboratoire lorsque les conditions de croissance étaient défavorables.
Les chlamydospores sont des cellules de forme et de taille variables, généralement présentes sur des cultures âgées. Elles sont localisées au sein d’agglomération d’hyphes, en association avec les sclérotes, lorsque le champignon est contaminé par d’autres organismes. Ce sont des cellules intercalaires ou terminales, issues de la transformation de parties du mycélium végétatif et qui sont libérées lors de la désintégration de l’hyphe. Leur fréquence est plus importante sur les lésions anciennes. Elles peuvent servir, à court de terme, de structure de survie lors que les conditions rencontrées à la surface de l’hôte sont défavorables (Elad et al., 2004).
Les conidies, les sclérotes, les ascospores, les chlamydospores ou encore les fragments de mycélium représentent tous une source éventuelle d’inoculum pouvant entrainer un nouveau cycle d’infection. Au cours d’une saison, plusieurs cycles peuvent être accomplis : la maladie
Figure 3 Cycle de vie de Botrytis cinerea. Source : Agrios, Plant Pathology, 2005
Figure 4 Bassins de production de laitues en France. Source : Agreste 2010
Figure 6 Bassins de production de tomates en France. Source : Agreste 2010
5 est dite polycyclique (Williamson et al., 2007).
Le processus infectieux de B. cinerea se décompose en plusieurs étapes : la pénétration de la plante hôte, la formation de lésions primaires, l’expansion des lésions et la macération des tissus puis la sporulation (Van Kan, 2006 ; Figure 3). Des températures comprises entre 18 et 23°C ainsi qu’un environnement humide sont des conditions optimales pour la croissance et la sporulation du champignon ainsi que pour l’établissement de l’infection (Agrios, 2005). Lors de la germination, les spores produisent un tube germinatif qui pénètre généralement les tissus à travers des blessures ou des ouvertures naturelles puis se différencie en mycélium (Agrios, 2005). B. cinerea peut également pénétrer la surface de l’hôte directement, avec la formation d’un appressorium à l’extrémité du tube germinatif, qui sécrète vraisemblablement des enzymes capables de dégrader la paroi cellulaire (Van Kan, 2006). Après infection et mort des tissus hôtes, le champignon peut survivre et sporuler comme saprophyte sur les tissus nécrosés. Le mycélium du champignon se développe dans les tissus et produit des conidiophores. Lorsque les conditions environnementales sont défavorables, des sclérotes sont formés.
II. Laitues et tomates, des cultures particulièrement affectées par Botrytis cinerea 1. La laitue
a) Importance économique
La laitue (Lactuca sativa) est une plante annuelle cultivée qui appartient à la famille des Asteraceae. Il s’agit de la salade la plus consommée au monde. Parmi les plus grands producteurs, on trouve la Chine, suivie de loin par les Etats-Unis (Source : FAOSTAT). En Europe, la France est le troisième plus grand producteur après l’Espagne et l’Italie. La campagne de production française 2009-2010 représentait 11 496 hectares cultivés et une production de 321 018 tonnes. Le plus grand bassin de production est situé dans le Sud-Est, et représente 51,3% de la production nationale (Figure 4 ; Source : Agreste 2010).
b) Botrytis cinerea – conditions de développement et principaux symptômes
La laitue est la cible de nombreux agents pathogènes (champignons, bactéries, virus) causant des dégâts plus ou moins importants sur les cultures. Parmi les maladies les plus sévères sont régulièrement cités le mildiou (Bremia lactucae), la sclérotiniose (Sclerotinia sclerotorium et S. minor) et la pourriture grise (Botrytis cinerea).
B. cinerea a été signalé dans pratiquement toutes les zones de production de salade dans le monde (Chine, Corée, Japon, Inde, Etats-Unis, Europe, …). Généralement, les attaques sont plus sévères sous abris. Ceci est en partie dû à la nature des tissus des plantes produites, plus tendres et succulents et à l’environnement, souvent plus humide. Les cultures de plein champ ne sont pas épargnées pour autant, notamment lors de périodes pluvieuses ou à la suite d’irrigation par aspersion. B. cinerea peut également causer des dégâts sur salade après la récolte, durant le stockage (Blancard et al., 2003) .
Les symptômes causés par B. cinerea sur salades sont variés. Lorsque le champignon est en contact avec des semences exposées à des conditions humides ou bien lorsque les semis sont trop denses, il peut être à l’origine de fonte des semis. Durant la culture, les attaques - isolées ou en foyers - se caractérisent par un flétrissement rapide des plantes lié à une altération du système vasculaire. L’agent de la pourriture grise se développe essentiellement à partir du
Figure 5 Laitue infectée par Botrytis cinerea. Le collet et les feuilles sont recouverts d’une pourriture humide. Source : INRA
a. b.
c. d.
Figure 7 Symptômes caractéristiques de Botrytis cinerea observables sur les différents organes aériens de la tomate (a. fleurs, b. feuille, c. fruit, d. tige).
6 stade pommaison de la salade. Les vieilles feuilles sont alors recouvertes par les plus jeunes, elles reçoivent moins de lumière, sont plus ou moins tassées contre le sol et restent en permanence humides en raison de l’absence d’aération du collet à ce stade de la culture. Ces feuilles sénescentes représentent une base nutritive très intéressante pour ce champignon opportuniste. Elles sont ainsi rapidement envahies et recouvertes d’une pourriture humide, marron à brune. Les feuilles contigües sont atteintes, et le collet est altéré (Figure 5). Les attaques peuvent aussi débuter sur de jeunes feuilles avec l’apparition de tâches humides et brunes en bordure de limbe. La pourriture se généralise par la suite à l’ensemble de la pomme. Les portes-graines ne sont pas épargnés, notamment au stade de la floraison. Les pièces florales sénescentes constituent des bases nutritives très propices à l’installation du champignon pouvant entrainer la contamination de certaines graines (Blancard et al., 2003).
2. La tomate
a) Importance économique
La tomate (Solanum esculentum) est une plante cultivée appartenant à la famille des Solanaceae. Il s’agit, après la pomme de terre, du légume le plus consommé au monde. La production mondiale n’a cessé d’augmenter au cours du XXème siècle et s’est
considérablement intensifiée ces 30 dernières années. La Chine est le plus grand producteur de tomates - 40 millions de tonnes - suivi par les Etats-Unis, la Turquie, l’Inde, l’Egypte et l’Italie qui en produisent entre 6 et 14 millions de tonnes (Source : FAOSTAT, 2008). La France représente 5% de la production européenne, derrière l’Italie, l’Espagne, la Grèce et le Portugal. La campagne de production 2011 sous serre représente 1854 hectares cultivés et une production estimée à 552 821 tonnes. Le Sud-Est et l’Ouest sont les bassins de production les plus importants et représentent respectivement 44,1 et 35,4% de la production nationale (Figure 6 ; Source : Agreste, 2010).
b) Botrytis cinerea – conditions de développement et principaux symptômes
La tomate est exposée à de nombreux ravageurs et agents pathogènes (insectes, nématodes, champignons, bactéries, virus, …). Parmi les champignons phytopathogènes, B. cinerea est l’un des plus connus en raison des dégâts importants qu’il cause.
Affectant quasiment toutes les zones de production dans le monde, il sévit aussi bien en plein champ que sous abris. Dans ce dernier contexte, il est particulièrement redouté pour des raisons identiques à la laitue (environnement plus humide, production de tissus tendres et gorgés d’eau). De plus, la durée de culture des plants de tomate est souvent très longue et les plantes présentent de nombreuses blessures d’effeuillage et d’ébourgeonnage, très favorables à son installation. Le champignon peut affecter tous les organes aériens de la tomate : les fleurs, les feuilles, les fruits et la tige (Figure 7). De façon générale, les tissus des organes affectés se couvrent d’une moisissure grise très caractéristique, constituée des conidiophores et des conidies du champignon (Blancard et al., 2009).
Comme chez la laitue, il peut être responsable de fontes de semis. Sur plante, lorsque les folioles sont attaquées, des taches circulaires et humides, de teinte beigeâtre à brun clair, apparaissent. Celles-ci engendrent par la suite un dessèchement du limbe puis parfois une pourriture qui se propage aux feuilles entières, aux pétioles et à la tige. Les tissus s’effondrent et se nécrosent progressivement. Les plaies de taille et d’ébourgeonnage sont souvent à l’origine des lésions chancreuses présentes sur les tiges. Ces chancres évoluent et finissent par altérer les tiges sur plusieurs centimètres de long puis par les ceinturer, provoquant leur
7 affaissement et la mort des plantes (Nicot et Baille, 1996). Les pétales sénescents sont également une source nutritive pour cet agent pathogène. Ils lui permettent d’assurer ultérieurement des infections sur folioles et sur fruits. Les fruits verts, principalement, peuvent présenter des « taches fantômes », minces anneaux blanchâtres, de 2 à 10 mm de diamètre, renfermant une minuscule lésion nécrotique centrale. Ces symptômes correspondent à des infections avortées de B. cinerea et rendent les fruits non commercialisables (Blancard et al., 2009).
3. Stratégies de lutte en culture de tomates et laitues
A ce jour, la maîtrise des épidémies de pourriture grise est ardue, notamment sous abris. Plusieurs raisons expliquent cette situation. Tout d’abord l’environnement y est souvent plus humide qu’en plein champ favorisant le développement de la maladie. De plus, les organes des plantes produites sont plus tendres et emmagasinent davantage d’eau. Enfin, concernant la tomate, les blessures de taille et d’ébourgeonnage sont très propices à l’installation de B. cinerea.
a) Lutte chimique
La lutte chimique reste encore le principal moyen de lutte pour réduire l’incidence de B. cinerea sur les cultures de laitues et de tomates. En cas d’apparition de symptômes, il est possible de traiter avec un des fongicides homologués. La mise en place de traitements préventifs est également envisageable notamment à la suite des effeuillages sur tomates afin de protéger les plaies de taille. Toutefois, parmi les sept substances actives autorisées pour ces cultures en France (iprodione, fenexamid, pyriméthanil, pyraclostrobine en association avec boscalid (510) et cyprodinyl associé au fludioxonil ; Source : e-phy) au moins trois appartiennent à des familles chimiques très concernées par des phénomènes de résistance (Leroux et al., 2002). Ceci s’explique par le nombre limité de matières actives qui ne permet pas d’alterner judicieusement les traitements et par la faible diversité de mode d’actions des fongicides disponibles. Par ailleurs, B. cinerea possède une capacité à s’adapter rapidement aux fongicides qui lui sont opposés (Ajouz et al., 2009). Par conséquent, le développement de ces résistances constitue un réel obstacle au contrôle de ce champignon.
b) Lutte biologique
Les premières études d’écologie microbienne de la phyllosphère ont montré qu’un certain potentiel existait dans la lutte biologique contre Botrytis avec l’utilisation d’antagonistes microbiens (champignons et bactéries). A ce jour, neuf produits ont été approuvés (Ajouz, 2009) pour un emploi sur des cultures en serres, sous tunnels plastiques ou en plein champs dans plusieurs pays. Ils ont atteint des niches commerciales dans des situations où l’utilisation excessive de fongicides a été limitée en raison d’une accumulation des résidus ou de restrictions imposées par des pays importateurs (Williamson et al., 2007). Des méthodes de lutte originales ont aussi été expérimentées. En Grande-Bretagne, des extraits de composts ont été pulvérisés sur des plantes, réduisant les dégâts et augmentant le rendement des cultures. En Israël, des antioxydants et des huiles essentielles ont été utilisés pour freiner le développement du champignon (Blancard et al., 2003). En France, seul le produit Serenade (Bacillus subtilis) a été homologué sur cultures de tomates et laitues (Source : e-phy) et le champignon antagoniste Microdochium dimerum est actuellement en cours de développement industriel en vue d’une homologation sur tomates (Source : Agrauxine).
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c) Mesures prophylactiques
Parmi les méthodes de luttes disponibles, une attention toute particulière doit être portée aux mesures prophylactiques. En complément des autres moyens de lutte, il s’agit d’une stratégie efficace pour limiter les dégâts causés par B. cinerea.
Une aération optimale des abris est essentielle, notamment en période de temps couvert et humide, afin de diminuer l’hygrométrie ainsi que la présence d’eau libre sur les plantes. Le chauffage est également une option intéressante. Sur laitues, il est préférable d’éviter la mise en place d’écran thermique qui augmenterait l’humidité (Blancard et al., 2009).
L’irrigation doit être privilégiée le matin ou en début d’après-midi, afin de permettre aux plantes de sécher et d’évaporer rapidement L’accumulation d’eau par les plantes rendent les tissus plus sensibles à B. cinerea.
La taille des plants de tomate doit être régulière et soignée. Bourgeons axillaires, feuilles et hampes des bouquets doivent être coupés au ras des tiges et de préférence le matin (Decognet et al., 2010). Les plaies ont ainsi davantage de temps pour sécher au cours de la journée. Le curage des jeunes chancres, consistant à retirer les tissus infectés, doit permettre d’éviter la propagation du champignon aux tissus sains. L’effeuillage de la partie basse des plantes permet d’améliorer le climat du couvert végétal à travers une meilleure circulation de l’air dans la culture (Blancard et al., 2009).
L’élimination des débris végétaux en cours et en fin de culture est primordiale. Ils ne doivent pas être laissés au sol surtout si celui-ci est humide. Leur enfouissement doit également être évité afin d’empêcher l’agent pathogène de s’y conserver.
Sous abris, il est préférable entre chaque culture d’opter pour un vide sanitaire, de remplacer le plastique couvrant le sol et de désinfecter soigneusement la serre.
La fertilisation azotée doit être raisonnée : ni trop faible, ce qui engendrerait des feuilles chlorotiques – idéales pour le développement du champignon, ni en excès, ce qui produirait des tissus succulents très réceptifs. L’impact de la fertilisation sur la pathogénicité de B. cinerea a été plusieurs fois démontré sur de nombreuses cultures hôtes (Hoffland et al., 1999 ; Davidson et al., 2004 ; Pitchay, 2007). Sur tomate, l’enrichissement des tissus en azote réduirait fortement sa sensibilité à ce champignon (Lecompte et al., 2010).
La préparation du sol des futures parcelles est une étape très importante. Le sol doit être drainé pour éviter la formation de flaques d’eau stagnantes. En plein champ, les cultures peuvent être orientées dans le sens des vents dominants afin de permettre une aération suffisante du collet des plantes. Une densité de plantation trop importante est à proscrire. Les rotations culturales sont habituellement reconnues comme une méthode efficace pour réduire l’impact d’un agent pathogène dans le temps. La nature polyphage de B. cinerea et son comportement saprophyte sembleraient limiter l’intérêt de cette technique.
Les autres bio-agresseurs doivent également être maitrisés afin d’éviter l’apparition de blessures, propices à l’infection de B. cinerea (Blancard et al., 2003).
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III. Intérêt de l’étude de la structure génétique des populations 1. Efficacité limitée des méthodes de lutte existant
Que cela soit pour B. cinerea ou d’autres champignons phytopathogènes, la lutte chimique s’est longtemps imposée comme une solution incontournable. Toutefois, l’apparition et la multiplication des phénomènes de résistances aux fongicides a fortement limité son efficacité. Par ailleurs, de nombreux fongicides ont été retirés du marché ces dernières années. Les effets néfastes des pesticides sur la santé et l’environnement ont largement été pointés du doigt depuis quelques années, contribuant ainsi à l’essor d’une prise de conscience environnementale au sein de la société. La réglementation sur leur usage s’est ainsi durcie. A la suite du Grenelle de l’Environnement, la France s’est engagée à réduire de 50% l’emploi des pesticides à l’horizon 2018. Au niveau européen, les états membres ont récemment adopté une directive visant à un « usage durable des pesticides » (Directive 2009/128/CE).
L’efficacité de la lutte biologique est également limitée dans certaines situations. Un des problèmes récurrents rencontrés avec cette méthode de lutte est l’irrégularité de son efficacité au champ (Elad et Stewart 2004). Ceci peut être attribué à différents facteurs comme les variations climatiques, le manque de compétence écologique des agents de lutte, la qualité variable des produits, et la variabilité de sensibilité des pathogènes aux agents de lutte biologique (Ajouz et al., 2009).
2. Informations apportées par la génétique des populations
La phytopathologie moderne, face aux difficultés rencontrées avec le contrôle des champignons phytopathogènes, a dû s’adapter et rechercher des solutions innovantes. Ainsi, depuis une vingtaine d’années, elle s’est orientée vers l’étude de la structure génétique des populations fongiques afin d’élaborer de meilleures stratégies de contrôle (Mc Donald, 1997). Pour B. cinerea, les recherches sur la structure génétique de ses populations se sont ainsi intensifiées et quelques articles scientifiques traitent à présent de ce sujet (Giraud et al., 1997 ; Alfonso et al., 2000 ; Muñoz et al., 2002 ; Ma et Michailides, 2005 ; Fournier et Giraud, 2008 ; Iseneger et al., 2008 ; Karchani-Balma et al., 2008 ; Rajaguru et Shaw, 2010 ; Valiuskaite et al., 2010).
La génétique des populations permet par exemple de livrer des informations sur le mode de reproduction de l’agent pathogène. Il est essentiel de pouvoir prédire les flux de gènes dans les populations et la transmission de caractères importants telle que la résistance aux fongicides (Baraldi et al., 2002). Elle permet également de différencier génétiquement des populations d’un même champignon qui pourraient ne pas avoir le même potentiel pathogénique ou le même niveau de résistance aux fongicides. Dans ce cas, pour réduire efficacement l’impact de cet agent pathogène, la stratégie de lutte à adopter ne serait pas la même d’une population à l’autre (Muñoz et al., 2002).
3. Les marqueurs microsatellites : des outils moléculaires performants
Différents outils moléculaires sont disponibles pour analyser la structure génétique d’une population de micro-organismes tels que les champignons. Parmi ceux régulièrement cités, on retrouve les RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism), les RAPDs (Random
Amplification of Polymorphic DNA), les AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms) et les microsatellites ou SSRs (Simple Sequence Repeats). Dans le cadre de
Figure 8 Représentation schématique d’un marqueur microsatellite. Les séquences flanquantes définissent la spécificité d’un microsatellite.
10 cette étude, on ne m’intéressera qu’aux microsatellites.
Les microsatellites sont des séquences d’ADN constituées de répétitions en tandem de motifs mono-, di-, tri- ou tétranucléotidiques (Figure 8). Les plus courants sont (A)n, (TC)n, (TAT)n,
(GATA)n, etc., avec une valeur de n variant de quelques unités à plusieurs dizaines (De
Vienne, D., 1998). La spécificité d’un microsatellite est définie par les régions flanquantes qui l’entourent. Celles-ci doivent être uniques. Une paire d’amorces spécifiques - fragments d’ADN complémentaires de ces régions uniques - permet de l’amplifier (De Vienne, 1998). Sur la base du polymorphisme, les microsatellites permettent de livrer des données exploitables pour l’analyse génétique des populations.
Ils sont largement utilisés comme marqueurs génétiques et pour plusieurs raisons. Présents chez de nombreux organismes Eucaryotes, ils sont régulièrement répartis dans leur génome. Ils sont également simples à interpréter, co-dominants, reproductibles, supposés neutres et présentent un niveau de polymorphisme très élevé (polymorphisme d’unités de répétitions) (Dutech et al., 2007). Concernant B. cinerea, neuf marqueurs microsatellites ont été développés et se sont révélés hautement polymorphiques pour des isolats provenant d’hôtes variés (Fournier et al., 2002). Depuis, plusieurs études traitant de la structure génétique de B. cinerea ont étés menées avec ces nouveaux marqueurs. Fournier et Giraud (2008) ont étudié la structure génétique de souches prélevées sur vigne et ronce dans six régions de France. L’objectif était de montrer une éventuelle différence entre ces populations selon leur plante hôte et leur origine géographique. Iseneger et al. (2008) ont cherché à révéler la structure génétique de populations de B. cinerea collectées dans 4 régions différentes du Bangladesh sur des cultures en plein champ de pois chiche. Karchani-Balma et al. (2008) ont étudié la variabilité génétique, le mode de reproduction et la différenciation selon l’hôte, la géographie, et le système de production (serre ou plein champ) de plusieurs populations tunisiennes de ce champignon. Kretschmer et Hahn (2008) ont évalué le degré de diversité génétique de souches de B. cinerea prélevées en Allemagne sur une vigne régulièrement traitée.
IV. Problématiques de l’étude : état actuel des connaissances
A partir de la caractérisation d’isolats de B. cinerea prélevés dans le sol ainsi que sur laitues et tomates, cette étude s’est intéressée à quatre problématiques : (1) B. cinerea présente-t-il une spécificité d’hôte ? (2) l’inoculum se transmet-il sur des cultures successives d’un même tunnel ? (3) l’inoculum est-il disséminé d’un tunnel à un autre ? (4) existe-t-il des flux d’isolats entre les compartiments sol et plante ? L’état actuel des connaissances disponibles est exposé ci-dessous.
1. Botrytis cinerea présente-t-il une spécificité d’hôte ?
Il a longtemps été pensé que B. cinerea était un champignon phytopathogène généraliste et qu’il n’avait pas de spécificité d’hôte (Jarvis, 1980 ; Lorbeer, 1980). Ceci s’explique premièrement par l’importante gamme d’hôtes et de tissus qu’il est capable d’attaquer et deuxièmement par l’infection, sous conditions expérimentales, de nombreux types de plantes et d’organes par de nombreuses souches. Pourtant, de récentes études sur la génétique des populations de ce champignon ont montré qu’il existait une différenciation génétique significative parmi des souches collectées sur différentes plantes hôtes. En France, Diolez et al. (1995) ont démontré que des souches de B. cinerea contenant l’élément transposable Boty étaient présentes sur vigne et tomate mais pas sur lentilles. Giraud et al. (1999) ont signalé que la fréquence des souches transposa et vacuma était significativement différente dans les
11 populations de B. cinerea prélevées sur différentes plantes hôtes. Au Chili, Muñoz et al. (2002) ont montré que des souches prélevées sur vigne et tomate étaient génétiquement différenciées. Plus récemment, Rajagura et Shaw (2010) ont reporté un résultat similaire entre des populations prélevées sur des framboisiers et des mûriers en Angleterre. A la vue de ces études de génétique, il semblerait que l’agent de la pourriture grise pourrait présenter dans certaines situations une spécificité d’hôte, contredisant ainsi les hypothèses initiales.
La réalisation de tests d’agressivité représente une autre approche susceptible de détecter une éventuelle spécificité d’hôte. Ces tests consistent à comparer l’agressivité de souches issues de plantes hôtes différentes. Parmi ces souches, certaines sont inoculées sur leur hôte d’origine et d’autres, non. Une étude a clairement mise en évidence que des souches génétiquement différentes, issues de tomate et de vigne, ne présentaient pas la même capacité à infecter des feuilles de tomates. En effet, les souches prélevées sur tomate étaient beaucoup plus agressives que celles prélevées sur vigne (Cotoras et Silva, 2005). Cette étude confirme de précédents résultats montrant que des souches issues de vigne étaient agressives sur cette plante, tandis que celles provenant de d’autres plantes hôtes ne l’étaient pas (Derckel et al., 1999). Pie et Brower (1993) ont également rapporté que des souches de B. cinerea collectées sur des roses présentaient une agressivité plus élevée sur des pétales de rose que des souches provenant de fleurs de gerbera ou de feuille de pois.
La laitue et la tomate sont deux cultures particulièrement affectées par B. cinerea. Les études citées précédemment indiquent toutes l’existence d’une spécificité d’hôte mais à ce jour, il semblerait qu’aucune n’ait été encore réalisée avec ces deux plantes hôtes. L’intérêt de l’existence d’une telle spécificité serait d’associer des cultures de tomates et de laitues en vue de limiter l’impact de B. cinerea.
2. L’inoculum de Botrytis cinerea se transmet-il sur des cultures successives d’un même tunnel ?
L’évolution de l’inoculum dans le temps est une question qui semble avoir été très peu étudiée jusqu’à maintenant. Alfonso et al. (2000) ont étudié la diversité génétique de populations de B. cinerea collectées dans des serres de légumes en Espagne. Les isolats ont été prélevés deux années consécutives dans les mêmes serres. Leurs résultats montrent qu’il n’y avait pas de différenciation entre les populations selon l’année de prélèvement. Connaitre le comportement de l’inoculum au cours du temps est pourtant essentiel pour la mise au point de méthodes de lutte efficaces. En effet, il est important de savoir si, d’une culture à l’autre, les populations de B. cinerea à l’origine d’attaques possèdent les mêmes caractéristiques telles une résistance à certaines fongicides.
3. L’inoculum de Botrytis cinerea est-il disséminé d’un tunnel à un autre ?
Alfonso et al. (2000) ont démontré qu’il existait une faible différenciation génétique entre des souches de B. cinerea collectées dans des serres provenant de la région d’Almería en Espagne. Une migration continue des gènes entre les serres empêcherait une différenciation des populations et certaines pratiques culturales favoriseraient cette situation à travers la migration des conidies dans l’air. L’aération quotidienne des serres, la non prise en charge des déchets de cultures qui représentent une source d’inoculum non négligeable ou encore l’utilisation d’insectes pollinisateurs seraient à l’origine de ce phénomène. Moyano et al. (2003) ont obtenu des résultats similaires dans cette même région. Ma et Michailides (2005) ont rapporté qu’il n’y avait pas de différence génétique significative entre des populations
12 californiennes de B. cinerea prélevées sur un même site ainsi qu’entre deux zones distantes de 6,5 km. L’hypothèse d’une migration élevée des gènes via la dispersion des conidies dans l’air a été une nouvelle fois sérieusement suggérée.
A l’inverse, Calpas et al. (2006) ont signalé l’existence d’une spécialisation de B. cinerea selon la serre d’origine. Ces populations avaient été collectées sur des cultures de tomates provenant de 8 serres différentes et situées dans la région canadienne d’Alberta. Les différents sites de prélèvement étaient séparés de quelques kms à 600 kms. Par conséquent, la distance n’était pas l’unique facteur pouvant expliquer le développement de groupes distincts selon la serre d’origine. L’hypothèse émise par les auteurs est que huit mois par an le climat d’Alberta est peu propice à la dispersion de B. cinerea ce qui expliquerait le phénomène d’isolement de souches du champignon dans leur serre d’origine. Cette isolation faciliterait ainsi le développement de caractères distincts dans les populations présentes dans chaque serre. Par ailleurs, Calpas et al. (2006). ont émis une autre hypothèse, celle de l’incompatibilité végétative. Une population de l’agent pathogène établie dans un lieu précis pourrait ne pas ou peu échanger d’information génétique avec des isolats introduits à condition que ceux-là ne soient pas issus du même groupe de compatibilité végétative. Ces deux hypothèses peuvent ainsi expliquer l’existence d’une importante différenciation génétique entre des populations de B. cinerea issues de différents abris.
A la vue de ces études, un transfert de l’inoculum de B. cinerea entre des tunnels est envisageable et dépendrait notamment des conditions environnementales extérieures. Une plausible migration des spores implique un impact direct sur les stratégies de lutte à adopter, en particulier sur la gestion des résistances aux fongicides et pour les mesures prophylactiques. Concernant ces études, il est important de souligner que les serres étaient distantes de minimum quelques kms tandis que les tunnels de la présente étude ne le sont que de quelques mètres. Il sera donc intéressant de voir si l’inoculum peut-être également transféré sur une faible distance.
4. Existe-t-il des flux d’isolats entre les compartiments sol et plante ?
Il semblerait qu’aucune étude de génétique des populations n’ai encore traité cette notion de flux entre les compartiments sol et plante, du moins chez B. cinerea. La caractérisation génétique de populations prélevées dans le sol, avant et après culture, ainsi que sur laitues permettra de savoir si elles sont différenciées ou non et par conséquent si un transfert d’inoculum entre les deux compartiments est possible. Le sol pourrait représenter un réservoir d’inoculum non négligeable en accueillant celui des plantes. Il pourrait jouer un rôle de « compartiment transfert » en transmettant l’inoculum accumulé lors de précédentes cultures aux futures cultures. Par conséquent, une meilleure connaissance de l’inoculum du sol et sur plante ainsi que des flux pouvant exister entre ces deux compartiments permettrait de réduire plus efficacement l’impact de cet agent pathogène, notamment à l’aide de pratiques culturales adaptées.
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I. Contexte expérimental 1. Sites d’expérimentation
Une partie des prélèvements a été réalisée sur le site de l’unité expérimentale INRA d’Alenya (66). Cette unité concentre ses travaux sur la production intégrée sous abri des cultures légumières dans la région méditerranéenne. Sur les 19 hectares que couvre le domaine, 10 000 m² sont alloués aux serres chauffées et tunnels dans lesquels coexistent cultures en sol et hors sol. Cette étude s’est intéressée aux systèmes de culture en sol sous abri. L’une des principales productions sous abri de l’unité est la laitue. Elle y est cultivée de septembre à mai sous tunnels plastiques (32 x 16 m) et peut être alternée avec des cultures de tomates ou de concombres. La culture de tomates s’effectue toute l’année, en alternance avec d’autres cultures sous tunnels.
L’autre partie des prélèvements de souches de Botrytis cinerea a été effectuée sur le site INRA de l’unité de pathologie végétale d’Avignon (84). Les recherches de cette unité se focalisent sur les maladies bactériennes, fongiques et virales des fruits et légumes du bassin méditerranéen. Elle a pour objectif le développement de méthodes de lutte efficaces et raisonnées dans un contexte de production agronomique durable et de haute qualité. D’une surface totale de 10 hectares, ce site possède 2100 m² de serres et 800 m² de tunnels. Pour la réalisation d’expérimentations en conditions contrôlées, l’unité de pathologie végétale bénéficie de chambres de cultures climatisées.
2. Cultures et itinéraires techniques
Site d’Avignon
Cultures de laitues sous tunnels
Entre 2006 et 2008, quatre cultures de laitues se sont succédé dans deux tunnels (T1 et T6). D’une surface de 128 m² chacun, ils étaient non mitoyens, séparés par quatre autres tunnels. Tous deux contenaient 14 rangs de 93 laitues avec une densité de plantation de 12 plants/m². Deux variétés différentes ont été cultivées : ‘Faustina’ et ‘Leandra’. Les cultures de salades ont été conduites sur un paillage plastique micro-perforé et l’arrosage était réalisé par aspersion. Le climat à l’intérieur des tunnels était géré via l’ouverture automatique d’ouvrants. Le sol n’a subi aucun traitement de désinfection entre les cultures. Les dates de plantation et de récolte sont indiquées ci-dessous (Tableau 1). Les tunnels 1 et 6 sont rattachés à l’étude du transfert de l’inoculum sur des cultures successives et entre tunnels.
‘Faustina’ ‘Leandra’ ‘Leandra’ ‘Leandra’
Plantation 5 avril 2006 30 novembre 2006 3 avril 2007 15 novembre 2007
Récolte 18 juin 2006 19 mars 2007 31 mai 2007 19 février 2008 Tableau 1 Dates de plantation et de récolte de cultures successives de laitues dans les tunnels 1 et 6, site d’Avignon. Deux variétés ont été cultivées : ‘Faustina’ et ‘Leandra’.
14 Site d’Alénya
Cultures de tomates et laitues sous tunnels
Les cultures ont été réalisées en 2009 et 2010, dans deux tunnels mitoyens, nommés tunnel 7 (T7) et tunnel 8 (T8), situés à l’ouest du domaine. Le T7 est relié à l’étude des flux d’isolats entre les compartiments sol et plante tandis que le T8 se rapporte à l’étude de la spécificité d’hôte chez B. cinerea. Le T7 contenait uniquement des laitues, 28 rangs de 150 plantes avec une densité de plantation de 14 plants/m². Dans le T8 ont cohabité des laitues et des tomates pendant la saison printanière. Six rangs de 150 laitues encadraient 6 rangs de 75 pieds de tomates. La densité de plantation des tomates et des laitues était respectivement de 2 et 14 plants/m². Les dates de plantation et de récolte sont indiquées ci-dessous (Tableaux 2 et 3).
‘Fidel’ ‘Arcadia’ ‘Fidel’
Plantation 5 mars 2009 7 octobre 2009 11 janvier 2010
Récolte 21 et 22 avril 2009 2 décembre 2009 30 et 31 mars 2010
‘Zendria’ ‘Brenda’ ‘Zendria’ ‘Brenda’
Plantation 5 mars 2009 10 mars 2009 15 février 2010 19 février 2010
Récolte 12 mai 2009 28 mai 2009a 21 avril 2010 25 mai 2010a
Arrachage - 21 juillet 2009 - 19 juillet 2010
Tomates et laitues ont été cultivées sur paillage plastique. Le palissage, l’ébourgeonnage et l’effeuillage des plants de tomate ont été réalisés une fois par semaine. Afin de satisfaire leurs besoins hydriques, les tomates ont été arrosées au goutte-à-goutte via un système d’arrosage automatique déclenché selon la valeur de l’évapotranspiration par rapport à un seuil choisi. La valeur de ce seuil était déterminée en fonction du stade de développement des plantes. Quant aux laitues, elles ont été irriguées par un système à aspersion, déclenché manuellement en fonction des contrôles tensiométriques. Pour la bonne conduite des cultures, le climat au sein des tunnels a été régulé via des ouvrants présents sur les parois latérales et sur le toit. A l’inverse des ouvrants latéraux gérés manuellement, les ouvertures du toit étaient contrôlées automatiquement et régies par différents paramètres comme la température et l’hygrométrie intérieure ou encore les précipitations extérieures.
Depuis 2008, cinq cultures de laitues de trois variétés différentes (‘Fidel’, ‘Zendria’ et ‘Arcadia’) se sont succédé dans le T7. Après la troisième culture, une désinfection du sol par solarisation a été menée du 19 juin au 5 octobre 2009. En revanche, aucune opération de désinfection du sol n’a été conduite dans le T8.
Tableau 3 Dates de plantation et de récolte de cultures de laitue et de tomate dans le tunnel 8, site d’Alénya. Deux variétés ont été cultivées : ‘Zendria’ (Laitue) et ‘Brenda’ (Tomate).
Tableau 2 Dates de plantation et de récolte de cultures de laitue dans le tunnel 7, site d’Alénya. Deux variétés ont été cultivées : ‘Fidel’ et ‘Arcadia’.
a
A partir de ce jour, tomates récoltées 2 fois par semaine jusqu’à l’arrachage complet des plantes.
Figure 9 Les différentes étapes de purification des isolats par isolement monospore.
3 jours à 21°C 18 h à 21°C
Coton-tige
Eau stérile
Etalement des spores jjjsur
Repiquage
Mise en suspension des spores
Etalement de spores sur lame gélosée Isolement d’une spore
germée sous microscope Transfert sur milieu
PDA Repiquage
2 jours à 21°C 15 jours
Oese
15
II. Collecte des isolats
1. Prélèvements d’isolats de Botrytis cinerea sur plantes
Sur les deux sites, des prélèvements de B. cinerea ont été réalisés sur laitues le jour même de leur récolte (cf. Tableaux 1, 2 et 3). Dans le T8, des échantillonnages du champignon ont également été effectués sur tomates. Ces prélèvements ont consisté à frotter, à l’aide d’un coton-tige stérile, des zones sporulantes de la plante. Les cotons-tiges ont ensuite été déposés dans des tubes Eppendorf puis stockés à -20°C, jusqu’à l’étape de purification.
2. Isolement de souches de Botrytis cinerea à partir d’échantillons de sol
Des prélèvements dans le sol ont été effectués dans le T7 quelques jours avant la plantation et après la récolte des laitues. Celui-ci a été divisé en huit blocs de surfaces égales dans lesquels quatre prélèvements ont été réalisés de façon aléatoire. Chaque prélèvement a été réalisé à la tarière et consistait en une carotte de sol d’environ 2 cm de diamètre. Ces échantillons de sol ont ensuite été conservés à -20°C, jusqu’à analyse.
Pour chaque prélèvement, 1 g de sol a été déposé dans 10 mL d’eau stérile puis deux dilutions de facteur 10 et 100, ont été réalisées. Trois aliquotes de 500 µL, de la suspension mère et des dilutions, ont ensuite été étalées, chacun sur 1 boite de Petri contenant un milieu semi-sélectif, le Botrytis Spore Trap Medium (BSTM) (Edwards et Seddon, 2001). Il s’agit d’un milieu contenant des antibiotiques non toxiques pour B. cinerea ainsi que de l’acide tannique, s’oxydant et prenant une couleur brunâtre une fois les colonies du champignon développées. Les boites de Petri ont été scellées à l’aide de parafilm et laissées à une vingtaine de degré, sous lumière naturelle, pendant 15 jours afin de permettre le développement de toutes les colonies. Celles présentant un mycélium caractéristique de B. cinerea - colonie circulaire avec mycélium ramifié et ras - ont été repiquées sur milieu Potato Dextrose Agar (PDA). Il s’agit d’un milieu non sélectif sur lequel B. cinerea se développe et sporule aisément. Son identité a pu être confirmée quelques jours après le repiquage par l’observation de formes caractéristiques de sporulation. Enfin, des spores de chaque isolat ont été prélevées avec un coton-tige stérile puis stocké à -20°C jusqu’à l’étape de purification.
III. Traitement des isolats 1. Purification des isolats
Avant la caractérisation génotypique et phénotypique des isolats, ceux-ci doivent être purifiés afin d’obtenir un seul génotype par prélèvement. Cette purification est réalisée par isolement monospore (Figure 9).
Chaque coton-tige stocké à -20°C et portant des spores a été frotté à la surface d’une boite de Petri contenant du PDA. Les boites ont ensuite été placées deux jours en chambre climatique (21°C, 14h d’éclairage/jour). Les colonies développées ont été repiquées et mises en culture (21°C, 14h d’éclairage/jour), le temps qu’elles sporulent. Quinze jours plus tard, des spores de chaque colonie ont été prélevées à l’aide d’une oese humide puis mises en suspension dans de l’eau stérile. Une goutte de cette suspension a ensuite été étalée sur une lame d’eau gélosée. Les lames ont été incubées 18 heures en chambre climatisée (21°C, 14h d’éclairage/jour), temps nécessaire à la germination des spores. Pour chaque lame, sous microscope, une spore germée et suffisamment isolée a été transférée sur une boite de Petri contenant du PDA. Afin
Figure 10 Contrôle de la qualité et de la quantité de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose. Les bandes blanches représentent l’ADN révélé sous UV à l’aide du BET. Les puits entourés en vert correspondent aux marqueurs de masse (20µg et 40µg). En comparant la fluorescence de chaque puits avec les puits de référence de masse, on estime la quantité d’ADN présente.
Tableau 4 Caractéristiques des 9 loci microsatellites décrits sur B. cinerea par Fournier et al. (2002).
