Caractérisation phénotypique : tests d’agressivité

Ces tests ont consisté à inoculer des plants de tomates, des feuilles de laitues et des pommes avec différentes souches de B. cinerea. L’objectif était de comparer les différentes souches entre elles sur la base de leur agressivité.

1. Choix des souches

Après la phase de génotypage, 40 souches – collectées dans le T8, sur des plants de laitue et de tomate cultivés simultanément - ont été sélectionnées selon leur profil génotypique. L’objectif a été de choisir des souches les plus distinctes possibles en se basant sur le polymorphisme de taille des neuf microsatellites. Pour chaque type d’hôte inoculé (tomates, laitues et pommes), deux tests d’agressivité ont été menés, chaque test avec un lot de 20 souches. Chaque lot contenait 10 individus prélevés sur tomates et 10 autres sur laitues. Ces tests devaient permettre d’observer une éventuelle différence d’agressivité entre ces souches selon leur plante hôte d’origine. Les souches utilisées ne provenant que de laitues ou de tomates, les effets de l’inoculation d’un troisième hôte (pomme), différent de ceux d’origine, semblaient intéressant à observer. Deux souches supplémentaires (BC 1 et BC 21), dites de « références » et dont est connu le comportement pathogène sur plantes, ont également été utilisées.

2. Production du matériel végétal

Deux lots de 69 plants de tomate (Solanum lycopersicum), cv. Swanson et deux lots de 40 plants de laitues (Lactuca sativa L.), cv. Mantilla ont été produits sous serres, chacun séparément. Les graines ont été semées dans un mélange de germination (Klasmann-Deilmann) de tourbe blonde et brune et de fibre coco. Les plantules de tomates et de laitues ont été repiquées respectivement une semaine et quatre jours après le semis, dans des pots en plastiques contenant un substrat de type TS3 Standard (Klasmann-Deilmann) composé d’un mélange de tourbe de sphaigne moyennement décomposé et d’argile. Selon leur besoin, les plantes ont été arrosées manuellement, une à plusieurs fois par jour, avec une solution nutritive Les pommes ont été achetées en grande surface. De la variété ‘Golden delicious’, deux lots de 69 ont été utilisés pour ces tests d’agressivité.

3. Test sur tomates

Réalisation des suspensions de spores

Pour chacune des souches, 2 µl d’une suspension de spores (stockée à -20°C ; solution de glycérol) ont été déposés dans 2 boites de Petri (PDA). Les boites ensemencées ont ensuite été placées en chambre climatique (21°C, 14h d’éclairage/jour) pendant 14 jours, temps nécessaire pour le développement mycélien et la sporulation du champignon. Le jour de l’inoculation, 3 mL d’eau stérile ont été ajoutés dans chaque boite et à l’aide d’un coton-tige, la gélose a été raclée afin de collecter le mycélium sporulant. Ce mélange d’eau, de mycélium et de spores a ensuite été versé dans une fiole remplie de billes de verre puis vortexé afin de séparer les spores des conidiophores. Le contenu a été filtré (mailles de 30 µm), ne laissant

20 passer que les spores et retenant ainsi le mycélium. Une dilution au 1/10^ème des suspensions obtenues a permis le comptage des spores à l’aide d’une cellule de Malassez sous microscope. Les suspensions ont ensuite été ajustées à une concentration de 10⁶spores/ml.

Inoculation des plantes avec les suspensions de spores

Trois plantes cv. Swanson, âgées de sept semaines, ont été inoculées pour chaque souche de B. cinerea. Les feuilles 4 et 6 de chaque plant de tomate ont été sectionnées au niveau du pétiole laissant sur la tige deux chicots d’environ 1 cm de longueur. Une goutte (10 µL) de suspension a été déposée sur chaque chicot et est rapidement absorbée par la plante.

Incubation et notation

Les plants de tomate inoculés ont été placés en chambre climatique (22°C, 16h d’éclairage/jour, 90% d’humidité relative) pendant sept jours. Durant cette période, les plantes ont été arrosées à la main, deux fois par jour. Trois jours après l’inoculation, la longueur des lésions engendrées par le champignon a été mesurée et ceci jusqu’au septième jour suivant l’inoculation.

Analyse des données

L’AUDPC (Area Under the Disease Progress Curves), qui correspond à la surface présente sous la courbe de progression de la maladie (Jeger et Viljanen-Rollinson, 2001), a été calculée de la manière suivante :

Avec Yj la longueur du chancre (en mm) au temps d’observation j, n le nombre total d’observations et I l’intervalle de temps entre chaque observation (en jours). L’AUDPC, exprimée sans unité, a ainsi été calculée pour chaque lésion avec n = 5 dates d’observations et I = 1 jour d’intervalle et ceci du troisième au septième jour suivant l’inoculation.

4. Test sur pommes

Réalisation des suspensions de spores

Les suspensions de spores ont été produites de manière identique à celles utilisées pour les tests sur tomates.

Inoculation des fruits avec les suspensions de spores

Trois pommes ‘Golden delicious’ ont été inoculées pour chacune des souches testées. A l’aide d’un cône stérile, deux trous d’1cm de profondeur ont été réalisés sur chaque pomme (un de chaque côté, sur l’équateur). Une goutte (10 µL) de suspension a ensuite été déposée dans chaque trou.

Incubation et notation

Les pommes ont été laissées en laboratoire à température ambiante (20°C). Trois jours après l’inoculation, la longueur des lésions engendrées par le champignon a été mesurée et ceci jusqu’au septième jour suivant l’inoculation.

21 Analyse des données

Les données ont été analysées de la même manière que le test sur Tomate, en calculant l’AUDPC.

5. Test sur laitues

Production des implants mycéliens

Trois jours avant l’inoculation des laitues, les souches ont été mises en culture. Pour chacune des 22 souches, 2µl d’une suspension de spores (stockée à -20°C ; solution de glycérol) ont été déposés sur deux boites PDA. Les boites ensemencées ont ensuite été placées en chambre climatique (21°C, 14h d’éclairage/jour) durant trois jours, temps nécessaire au développement mycélien du champignon.

Inoculation des feuilles de laitues avec les implants mycéliens

Des feuilles de laitues entières, de taille homogène, ont été prélevées sur les plants produits – âgés de cinq semaines - puis déposées dans des boites en plastique transparentes dont le fond avait été recouvert de papier absorbant humidifié (1 feuille par boite). Les implants mycéliens, d’un diamètre de 2 mm, ont été excisés à l’emporte-pièce à partir des cultures préparées trois jours plut tôt. Ils ont été disposés sur les organes foliaires (1 disque par feuille) en veillant à ce que le mycélium soit en contact avec le tissu végétal. Ces disques mycéliens ont systématiquement été placés aux deux-tiers de la longueur des feuilles, en partant de leur point d’attache. Au total, 198 feuilles ont été inoculées à raison de neuf feuilles par souche. Incubation

Une fois toutes les feuilles inoculées, les boites ont été fermées avec leur couvercle puis placées en chambre climatique (21°C, 14h d’éclairage/jour) pendant cinq jours.

Suivi et quantification des lésions

A partir du deuxième jour suivant l’inoculation, chaque feuille a été photographiée quotidiennement pendant trois jours afin d’observer l’évolution des lésions causées par le champignon.

A partir des photographies, la surface (mm²) des lésions présentes sur chaque feuille a été déterminée avec le logiciel ASSESS 2.0 (APS Press, St Paul, Minnesota). L’AUDPC a été calculée pour chacune des lésions avec n = 3 dates d’observations et I = 1 jour d’intervalle et ceci du deuxième au quatrième jour suivant l’inoculation.

6. Analyse statistique

Afin de savoir s’il existait ou non une différence d’agressivité significative entre les populations de B. cinerea issues de tomates et de laitues, le test non paramétrique de Mann-Whitney a été appliqué à l’aide du logiciel STATISTICA Edition ’99. Sur la base des AUDPC moyennes calculées pour chaque souche, il a testé l’hypothèse H0 : « Les deux populations sont identiques en terme d’agressivité ». Celle-ci était rejeté si la probabilité associé P était inférieure à 0.05.

22 Pour illustrer une éventuelle différenciation des souches testées selon leur plante hôte d’origine, deux Analyses en Composantes Principales (ACP) ont été réalisées avec le logiciel statistique R version 2.9.1 (R Development Core Team, 2009).

Nombre de souches génotypées Nombre moyen d'allèles par locus Nombre de GMLs distincts Diversité clonale (R) Laitue Total 44 9.2 30 0.67 2009 26 6.78 17 0.64 2010 18 6.2 15 0.82 Tomate Total 42 4.67 16 0.37 2009 29 3.78 12 0.39 2010 13 3.33 8 0.58 Nombre de copies Nombre de souches Laitue Nombre de souches Tomate GML a 2 1 1 GML b 4 1 3 GML c 12 5 7 GML d 14 6 8 Simpson D* Equitabilité ED* Laitue Total 0.969 0.758 2009 0.945 0.708 2010 0.98 0.714 Tomate Total 0.912 0.868 2009 0.879 0.785 2010 0.923 0.823 r_d Total 2009 2010 Laitues 0.24 0.268515 0.243537 Tomates 0.23 0.248561 0.255553