Caractérisation du greffage avec différentes architectures de SAM par

La spectrométrie à décharge luminescente (ou SDL) est une technique de caractérisation pour l’analyse de concentrations élémentaires d’échantillons solides permettant la réalisation de profils de concentrations. L’utilisation de cette technique pour la caractérisation de couches biofonctionnalisées ou de biointerfaces est relativement atypique. Il y a toutefois certains auteurs qui ont réalisé des analyses SDL pour étudier des monocouches formées sur substrat métallique268,269. Nous n’utiliserons pas cette technique pour l’analyse directe des différentes architectures de SAMs étudiées dans ce chapitre car cela nécessite des conditions de mesures optimales et une maîtrise complète de l’appareil. Cette étude a pour objet d’avoir une idée du potentiel de ce système pour l’étude d’immuno-interface. Nous souhaitons en effet quantifier le nombre de biorécepteurs immobilisés sur la surface du GaAs selon les différentes architectures employées.

Cette technique a un certain nombre d’avantages; (1) elle permet la détection simultanée de nombreux éléments chimiques (30 éléments détectables), (2) l’échantillon à mesurer ne nécessite pas de préparation particulière, (3) l’analyse est très rapide et s’effectue dans un vide primaire seulement. De plus, cette technique bénéficie d’un coût d’achat relativement modeste par rapport aux techniques SIMS ou XPS et un coût d’entretien réduit.

Le principe de fonctionnement est illustré par la Figure 3.31. L’échantillon est placé sur une anode dans une chambre à atmosphère d’argon sous faible pression. Une décharge radio- fréquence de plusieurs centaines de volts est appliquée entre l’anode et la cathode. Les ions argon créés vont former un plasma qui va pulvériser l’échantillon petit à petit (échantillon polarisé négativement). Les atomes présents en surface vont en être éjectés dans un état excité. Les photons générés lors du retour à l’état fondamental des atomes excités sont détectés par des photomultiplicateurs (un pour chaque élément car chaque élément à une longueur d’onde caractéristique). L’appareil utilisé dans cette étude est le GD Profiler® de HORIBA Scientific. Il est doté d’un monochromateur permettant la détection d’un élément supplémentaire, l’arsenic, non présent dans la liste des 30 éléments détectés par les photomultiplicateurs (tout comme le gallium). Pour ces expériences, sont utilisés, des échantillons de GaAs(100) de 12x12mm² seulement fonctionnalisés ou avec une biointerface complète.

Figure 3.31: Principe de fonctionnement de la spectroscopie à décharge luminescente (SDL) avec un exemple appliqué à la caractérisation de couches protéiques

La Figure 3.32a montre l’évolution des éléments arsenic et carbone pendant l’érosion d’un échantillon avec une monocouche de MHDA sur laquelle ont été immobilisés des anticorps. On peut voir une décroissance du profil de carbone et une croissance de celui d’arsenic indiquant l’érosion pendant les premières secondes de la couche protéique et de la monocouche puis celle du GaAs. Cinq types d’échantillons différents ont été mesurés de cette façon : MHDA, MHDA:MUDO (1:1), MHDA:MUDO (9:1), MUDO et du GaAs sans SAM. Une étape de greffage d’anticorps a été appliquée sur chaque échantillon selon le protocole énoncé dans la partie 3.8.1. Après rinçage, les échantillons ont été mesurés, un par un, dans le

GD Profiler donnant les profils d’intensité pour chaque élément sur chaque échantillon. Les

profils de soufre, azote et oxygène ont été étudiés mais sans révéler d’information pertinente sur la biointerface. Les profils de carbone pour chaque échantillon ont été tracés sur la Figure 3.32b. Les intensités de carbone sur les surfaces de MUDO sont non-nulles contrairement à ce que l’on obtient sur un échantillon sans SAM. On peut toutefois supposer que l’intensité de carbone mesurée correspond aux chaînes alkyles composant la monocouche. Sur la surface de GaAs nue, les anticorps n’ont pas pu adhérer, montrant que la procédure employée pour l’immobilisation n’autorise pas les adsorptions non-spécifiques des biorécepteurs sur les surfaces non-fonctionnalisées. Même si l’on considère qu’une partie des composantes carbones de la biointerface est reliée à la présence des chaînes alkyles sur les échantillons (monocouche), on peut cependant admettre que les monocouches mixtes (10% et 50% de MHDA) devraient avoir un profil de carbone de plus faible intensité que celui des échantillons

de MHDA (d’après les résultats obtenus par FTIR dans la partie 3.6.1). Or les mesures révèlent des résultats similaires pour les monocouches de MHDA à 100% et à 10% et une plus forte intensité pour la monocouche mixte à 50%. Ceci suggèrerait une plus forte présence d’anticorps sur les monocouches mixtes que sur celle de MHDA pure. C’est en accord avec les résultats présentés dans la partie 3.8.2.

Figure 3.32: (a) Profil SDL d’arsenic et de carbone pour un échantillon de GaAs avec des anticorps immobilisés sur une SAM de MHDA et (b) profil de carbone pour des échantillons avec

des anticorps immobilisés sur des SAMs de MHDA, MUDO:MHDA (1:1), MUDO:MHDA (9:1) et MUDO

3.9 Conclusion

Nous avons étudié dans ce chapitre plusieurs architectures d’alkanethiols mixtes ou pures utilisées pour l’élaboration de biointerfaces sur Arséniure de Gallium. Les monocouches mixtes MHDA/MUDO et MHDA/DDT ont été choisies pour améliorer la couverture de protéines/biorécepteurs sur la surface, et rendre plus accessible les groupes COOH pour l’immobilisation de ces protéines tout en limitant les adsorptions non-spécifiques. Une architecture pure à base de thiols à chaîne PEG et à terminaison biotine a également été étudiée.

La formation de couches mixtes a été étudiée par des mesures de tension de surface et par des caractérisations FTIR en transmission. Ces caractérisations ont pu mettre en évidence la prévalence des molécules DDT lors de la formation des SAMs mixtes MHDA/DDT. Ceci rend

presque inutilisable cette architecture pour le greffage covalent d’anticorps. Nous nous sommes donc focalisés sur l’étude des monocouches MHDA/MUDO et sur leur cinétique de formation, par adsorption simultanée et par remplacement de thiols. Nous avons pu déterminer approximativement les proportions surfaciques de ces composés et estimer comment évoluent la densité de surface de ces molécules et leur conformation en fonction des proportions en solution. L’analyse des SAMs hétérogènes MHDA/MUDO par mesure FTIR des vibrations νCH2as a révélé une modification du comportement d’auto-assemblage pour un rapport de 50%

entre le MHDA et le MUDO. Cela a pu être expliqué partiellement par une organisation de la SAM en deux phases combinées avec un phénomène de substitution des molécules entre elles. Nous avons observé les cinétiques de remplacement de ces deux composés sur GaAs, montrant une nouvelle procédure de formation d’architectures mixtes avec un meilleur contrôle des proportions.

Nous avons mis en évidence l’effet de la polarité du solvant sur la densité de la couche de SAM obtenue en utilisant des mélanges eau DI / éthanol. Cette étude a révélé l’impact de la longueur de la chaîne et du groupe terminal sur le processus d’auto-assemblage. Les monocouches les plus denses ont été obtenues avec un rapport eau/éthanol de 33% en volume donnant une densité de thiol doublée. Enfin le taux de greffage des biorécepteurs (anticorps) a été analysé par les techniques FTIR et SDL. En conclusion, nous pouvons affirmer que l’interface composée de PEG-biotin semble celle qui permet le greffage d’une couche plus dense de protéines, d’après les caractérisations FTIR, juste devant les couches mixtes composées de 10 % de MHDA et 90% de MUDO.

Ces résultats sur l’optimisation et l’étude des SAMs sont essentiels pour l’élaboration de biointerfaces stables dans le temps (densification des SAMs, meilleure conformation), rendant sensible (meilleur greffage) et spécifique (limitation des absorptions non-spécifiques) notre biocapteur en GaAs.

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