Caractérisation du tissu adipeux des souris PKR1 -/-

-/-La première partie de notre étude porte sur l’analyse du phénotype du tissu adipeux des souris PKR1^-/- afin de déterminer l’impact de l’inactivation de PKR1 dans ce tissu.

A l’âge de 40 semaines, les souris PKR1^-/- présentent une masse corporelle 40 % plus élevée que celle des souris WT (31,8 ± 0,8 g et 45,5 ± 4,5 g pour WT et PKR1^-/-, respectivement). Cette augmentation de poids est due, en grande partie, à une augmentation de la masse du tissu adipeux viscéral des souris PKR1^-/-, puisque celle-ci est 3 fois supérieure à celle du tissu adipeux des souris WT (Figure 20 A). Cette différence est visible à l’œil nu sur des photos de l’abdomen des souris (Figure 20 B). Nous avons également constaté une augmentation de la masse du foie issu des souris PKR1^-/- comparé au foie des souris WT (Figure 20 A).

Figure 20 : Masse corporelle et poids des organes des souris PKR1^-/-.

A) Histogrammes de la masse corporelle (en g) (à gauche), du poids du tissu adipeux (en mg) (au milieu) et du foie (en mg) (à droite) des souris WT (barre blanche) et PKR1^-/- (barre noire). (* : p<0,05 entre WT et PKR1^-/-). B) Photos de l’abdomen des souris WT (à gauche) et PKR1^-/- (à droite) permettant de voir les masses de tissus adipeux périgonadiques.

A)

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Figure 21 : Hyperplasie du tissu adipeux des souris PKR1^-/-.

A) Coupes semi-fines des tissus adipeux observées à un grossissement X20 qui permet de voir l’hyperplasie du tissu adipeux des souris PKR1^-/- (à droite) comparée à celui des souris WT (à gauche). B) Histogrammes représentant le nombre d’adipocytes (à gauche) et l’aire des adipocytes (à droite) présents au sein des masses adipeuses des souris WT (barre blanche) et PKR1^-/- (barre noire). Résultats exprimés en % par rapport au WT, WT correspondant à 100%. (* : p<0,05 entre WT et PKR1^-/-).

Etant donné la forte augmentation de masse adipeuse, nous nous sommes intéressés à la morphologie du tissu adipeux viscéral des souris WT et PKR1^-/- afin de savoir si cette augmentation de masse grasse était due à une augmentation du nombre d’adipocytes ou à une augmentation de la taille des adipocytes. Les coupes semi-fines des tissus adipeux nous révèlent que les souris PKR1 -/-présentent une obésité hyperplasique (Figure 21 A). En effet, nous observons que le nombre d’adipocytes double au sein du tissu adipeux des souris PKR1^-/- et que leur superficie diminue de 60% (Figure 21 B).

B) A)

100 L’hyperplasie du tissu adipeux provenant de la prolifération puis de la différenciation des préadipocytes, nous avons quantifié la prolifération des préadipocytes au sein des tissus adipeux des souris WT et PKR1^-/- par un coimmunomarquage dirigé contre les protéines Pref-1 et Ki67. Sur nos coupes de tissus adipeux issus des souris WT et PKR1^-/-, nous observons une colocalisation de Ki67 avec Pref-1, confirmant la prolifération des préadipocytes (Figure 22 A). De plus, la quantification des immunomarquages montre une augmentation significative du nombre de préadipocytes engagés dans la division cellulaire au sein du tissu adipeux des souris PKR1^-/- comparé au tissu adipeux issus des souris WT (Figure 22 B).

Figure 22 : Prolifération des préadipocytes dans le tissu adipeux des souris PKR1^-/-.

A) Représentation de la prolifération des préadipocytes dans les tissus adipeux des souris WT (à gauche) et PKR1^-/- (à droite), visualisée par un coimmunomarquage dirigé contre Pref-1 (rouge) et Ki67 (vert). Les noyaux sont marqués avec du Dapi (bleu). Les photos ont été prises à un grossissement X40. B) Quantification du nombre de cellules marquées pour Pref-1 et Ki67, exprimé en % par rapport au nombre total de cellules marquées par le Dapi. (* : p<0,05 entre WT et PKR1^-/-).

A)

B)

101 Le tissu adipeux est un organe richement vascularisé. La prokinéticine jouant un rôle important dans l’angiogenèse, nous avons contrôlé la vascularisation des tissus adipeux WT et PKR1^-/- par immunomarquage de la protéine PECAM-1 (Figure 23 A). Nous observons que le nombre de capillaires dans le tissu adipeux PKR1^-/- est identique à celui qu’on observe dans le tissu adipeux WT malgré l’augmentation du nombre d’adipocytes dans la masse adipeuse PKR1 -/-(Figure 23 B).

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Figure 23 : Vascularisation du tissu adipeux des souris PKR1^-/-.

A) Représentation du réseau vasculaire dans les tissus adipeux des souris WT (à gauche) et PKR1^-/- (à droite), visualisée par un coimmunomarquage dirigé contre le collagène (rouge) pour visualiser les contours des adipocytes et PECAM-1 (vert) afin de marquer les cellules endothéliales. Les noyaux sont marqués avec du Dapi (bleu). Les photos ont été prises à un grossissement X40. B) Quantification du nombre de cellules marquées pour PECAM-1 dans les tissus adipeux des souris WT (barre blanche) et PKR1^-/- (barre noire). Les résultats sont exprimés en % par rapport au nombre total de cellules marquées par le Dapi.

B) A)

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Figure 24 : Activité mitochondriale des adipocytes du tissu adipeux PKR1^-/-.

A) Représentation de l’activité de la SDH des mitochondries dans les tissus adipeux des souris WT (à gauche) et PKR1^-/- (à droite), visualisée par la coloration bleue de son activité enzymatique. Les photos ont été prises à un grossissement X40. B) Quantification du marquage de la SDH dans le tissu adipeux des souris PKR1^-/- (barre noire), exprimée en % par rapport au WT (barre blanche), WT correspondant à 100%. (* : p<0,05 entre WT et PKR1^-/-).

Pour vérifier la respiration des mitochondries des adipocytes, les coupes de tissus adipeux issus des souris WT et PKR1^-/- ont été colorées pour mesurer l’activité de la SDH (Figure 24 A). Le tissu adipeux des souris PKR1^-/- présente une coloration SDH 25% moins intense que celle du tissu adipeux des souris WT, témoignant de la plus faible activité respiratoire des mitochondries des adipocytes issus des souris PKR1^-/- (Figure 24 B).

Un défaut d’angiogenèse est souvent corrélé au développement de conditions hypoxiques qui entraînent l’expression du facteur de transcription induit par l’hypoxie HIF-1. Nous avons donc mesuré, par PCR semi-quantitative, le niveau d’expression de ce facteur hypoxique au sein des tissus adipeux (Figure 25 A). Le tissu adipeux des souris PKR1^-/- présente une forte augmentation de l’expression de HIF-1α comparé au tissu adipeux des souris WT, ce qui indique le développement d’un état hypoxique (Figure 25 B).

A)

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Figure 25 : Expression du facteur HIF-1 au sein du tissu adipeux PKR1^-/-.

A) Mesure de l’expression de GAPDH et de HIF-1α dans les tissus adipeux WT et PKR1^-/- par PCR semi-quantitative. B) Quantification de l’expression de HIF-1α par rapport à l’expression de GAPDH. Les résultats pour les souris PKR1 -/-(barre noire) sont exprimés en %, sachant que WT -/-(barre blanche) correspond à 100% d’expression (* : p<0,05 entre WT et PKR1^-/-).

Figure 26 : Adipocytes nécrotiques du tissu adipeux PKR1^-/-.

Représentation de l’ultrastructure des adipocytes issus des tissus adipeux WT (à gauche) et PKR1^-/- (à droite), analysée par microscopie électronique. Les adipocytes des souris PKR1^-/- présentent un noyau nécrotique, des mitochondries dilatées et une accumulation de gouttelettes lipidiques cytoplasmiques. nc : noyau, mtc : mitochondrie, bv : capillaire sanguin, lp : gouttelette lipidique.

B) A)

104 Nous avons voulons connaître les conséquences du défaut d’angiogenèse et de l’hypoxie au niveau des adipocytes issus des souris PKR1^-/-. L’ultrastructure de ces adipocytes montre qu’ils présentent des caractéristiques nécrotiques telles que la rupture de la membrane basale et une dégénération des organelles. La présence de mitochondries dilatées à crêtes désorganisées est accompagnée par la présence de gouttelettes lipidiques cytoplasmiques (Figure 26).

L’ensemble de ces résultats montrent donc que l’absence de PKR1 dans les souris mutantes conduit à une obésité hyperplasique due à la prolifération des préadipocytes. L’angiogenèse qui permettrait d’assurer une vascularisation correcte du tissu n’est pas assurée, ce qui crée un état hypoxique au sein du tissu adipeux. Cette hypoxie entraîne la nécrose d’une partie des adipocytes.