Objectif 1 : Étude de la spécificité d’antiQ 53
II. Caractérisation des mutants ponctuels (Mut antiQ) 60
Suite aux résultats obtenus pour les mutants Δ répétitions (antiQ), nous nous sommes intéressés à l’importance de certains nucléotides clés dans antiQ. Plus précisément, neuf nucléotides ont été modifiés en utilisant à nouveau la mutagénèse dirigée par amplification de plasmide. Les mutations étaient majoritairement introduites près du site de coupure (figure 3.1.9.), dans la première répétition seulement afin de permettre la conservation d’une région de 1,8 répétition complète qui suffit pour neutraliser ABIQ et maintenir la survie cellulaire. Les mutations plus éloignées du site de coupure servaient de contrôle (A13C et A40C) ou de clone test pour analyser l’effet d’une mutation dans la structure secondaire en pseudonoeud prédite (G32A). Afin de simplifier l’analyse des résultats, les positions des mutations ont été numérotées en marquant le début de la première répétition comme point de départ.
Figure 3.1.9. Représentation des mutations ciblées dans antiQ. La flèche rouge démontre le site de coupure de la première répétition.
Malgré plusieurs tentatives, nous n’avons pas obtenu de clones contenant les mutations G23A et C40A (tableau 3.1.2.). Ceci suggère que ces sites joueraient un rôle majeur dans la régulation de la toxicité d’ABIQ. Parmi les clones obtenus, seul le mutant A27C n’a pas été utilisé pour les expériences subséquentes.
Tableau 3.1.2. Fréquence d’obtention des clones mutants ponctuels antiQ.
L’efficacité anti-phage des mutants antiQ a d’abord été évaluée en utilisant le phage P008 (tableau 3.1.3.). L’expérience a été réalisée en duplicata biologique et chaque titre était évalué en triplicata. Tel que mentionné auparavant, l’EOP de P008 sur la souche AbiQ+ sauvage est de 10-5. Des données similaires
ont été obtenues pour les mutants A13C et T25C. À l’inverse, les mutations A24C, A26C et A28C mènent tous à un EOP de 1, donc une perte totale d’activité d’anti-phage. Il est a noté que le seul clone Mut A28C obtenu contient 3,8 répétitions (les deux premières répétitions possèdent cette mutation A28C). Cette acquisition d’une répétition complète est également survenue pour la mutation G32A. Toutefois, un clone G32A de 2,8 répétitions a aussi pu être isolé. L’EOP des deux clones G32A est de 10-8, indiquant
donc que cette mutation permet d’augmenter significativement l’activité anti-phage.
Par la suite, ces mêmes mutants antiQ ont été utilisés dans une expérience d’hybridation Northern et leur profil de digestion a été comparé les uns par rapport aux autres (tableau 3.1.3.). Les clones A13C et T25C possèdent un profil similaire de digestion que la souche sauvage. Pour les mutants A24C et A26C, une modification majeure a été obtenue en remplaçant partiellement (A24), ou totalement (A26), le fragment de 97 nt par celui de 106 nt. Ces bandes sont générées respectivement par une coupure d’antiQ complet dans la première répétition ou dans la dernière (0,8 répétition).
Donc, ces mutations spécifiques (A24C ou A26C) permettent de bloquer la coupure dans la première répétition ce qui favorise la coupure dans la dernière répétition (0,8 répétition). Une diminution partielle de la fréquence de coupure au premier site a également été observée pour le mutant A28C. Finalement, les mutants G32A et G32A-3,8 présentaient un profil de digestion similaire au sauvage. Toutefois, une augmentation significative du fragment 97 nt (1er site jusqu’au terminateur) a été observée. Il est possible
que cette modification permette d’augmenter la fréquence de coupure dans la première répétition, toutefois d’autres expériences seraient nécessaires afin de le confirmer.
Tableau 3.1.3. Résultats cumulatifs des activités anti-phage (EOP) et endoribonucléique pour les différents mutants antiQ (Northern : Sonde 1 répétition d’antiQ).
Afin d’expliquer ces observations, nous avons analysé la structure secondaire des ARNs mutants antiQ. Le logiciel RNAfold (Visualisation par Varna) a été utilisé pour déterminer la structure des ARNs antiQ complets (figure 3.1.10.). L’analyse de l’ARN sauvage démontre une accessibilité facile au site de coupure (A/AAA) dans antiQ. Autre observation intéressante, la région polyA de la portion 0,8 répétition est prédite pour former un rallongement de la structure tige boucle (terminateur T1 rho-indépendant séparant antiQ et le gène abiQ) par liaison avec les multiples T (U) à la fin du terminateur. Cela pourrait expliquer la faible fréquence de coupure dans cette dernière répétition. La mutation A24C mène à une modification majeure dans la structure de l’ARN ce qui positionne le site de coupure dans une zone plus restreinte. Un mésappariement dans la boucle adjacente pourrait également restreindre l’accessibilité de la protéine ABIQ au site de coupure. D’un autre côté, la base A26 serait essentielle à la reconnaissance et/ou coupure puisque la structure générale de l’ARN n’a pas été modifiée. La mutation A28C présente une mutation dans la structure, toutefois ce n’est pas clair si la modification du profil de coupure est déterminée par la structure ou la séquence. Les autres mutations ne présentaient pas de modification structurale importante permettant de cacher ou modifier directement le site de reconnaissance et/ou de coupure par ABIQ.
Figure 3.1.10. Comparaison des structures prédites des ARNs antiQ. antiQ complet (A), les différents mutants Δ répétitions (B, C) et les mutants ponctuels (D-J). Les nucléotides verts entourent le site de coupure alors que les rouges montrent le nucléotide muté.
La base G32 est la seule ayant été mutée qui appartient à la structure en pseudonoeud prédite. Le logiciel pknotsRG, en combinaison avec pseudoviewer3, a donc été utilisé pour analyser cette structure. Les résultats démontrent une modification majeure dans la structure en pseudonoeud du premier ARN mature (généré par la coupure dans la première et deuxième répétition) (figure 3.1.11.). Cette mutation formerait donc des ARN immatures incapable de se lier à la toxine, et expliquerait du même coup l’augmentation de l’activité anti-phage observé préalablement.
Figure 3.1
.
11.
Analyse de la structure en pseudonoeud d’antiQ chez le mutant AbiQ-(A32C). La structure de antiQ sauvage (gauche) et la structure antiQ-A32C ont été prédites par pKnotsRG. Seuls les nucléotides des répétitions sont inclus dans la séquence (T en remplacement de U pour simplifier l’analyse). Les flèches rouges démontrent le site G32 (sauvage) ou A32 (mutant).Nous nous sommes également demandé si ces différentes mutations pouvaient influencer la croissance des bactéries. À titre comparatif, les mutants Δ répétitions ont aussi été testés dans cette expérience. Les temps de génération (g) des clones mutés (sauf A28C) sont tous similaires entre eux, aux mutants Δ répétitions et à la souche avec AbiQ sauvage (60 minutes). Dans la littérature, on dénote un temps de dédoublement de 48 minutes pour L. lactis IL1403 (Panoff et al., 1994), différence qui est probablement due à la présence de l’antibiotique (chloramphénicol) présent pour la sélection du plasmide contenant AbiQ. Le mutant AbiQ (A28C) a un temps de dédoublement de 100 minutes, suggérant une modification importante au niveau de la régulation toxique. Toutefois, nous ne pouvons exclure pour l’instant la possibilité que des mutations extérieures à l’opéron AbiQ soient la cause de ce ralentissement de croissance.