Caractérisation des aquaporines de Populus trichocarpa

L’étude des banques de données a permis d’identifier 63 MIP putatives chez P.

trichocarpa. L’analyse à l’aide d’un algorithme de phylogénie moléculaire des séquences

protéiques prédites a permis de mettre en évidence que 10 de ces MIP sont homologues avec les PIP2 d’Arabidopsis thaliana, 6 peuvent être rattachées aux PIP1, 20 aux TIP, 13 aux NIP, 7 aux SIP, et 7 séquences se distinguent remarquablement des familles de MIP décrites jusqu’à présent (Figure 10). Ce nombre fait de Populus le genre ayant le plus de gènes codant pour des MIP. En terme de répartition, 25 % de ces gènes codent des PIP contre 36 % chez

Arabidopsis, environ 30 % codent des TIP et 20 % codent des NIP chez les deux genres. Les

SIP sont assez bien représentées chez Populus qui en compte 3,5 fois plus qu’Arabidopsis. Le peuplier est donc un modèle d’étude qui apparait comme plus complexe. Il a été choisi du fait de la disponibilité de l’intégralité de son génome dans les bases de données. Ceci pour avoir une vision globale de l’expression des gènes codant des MIP au cours des traitements considérés et pouvoir les associer à des réponses biologiques. Pour limiter l’étendue du champ d’investigation, nous avons restreint notre étude aux PIP1 et 2 qui sont décrites comme transporteurs d’eau et de CO2 dans la littérature. Les premiers travaux qui ont été réalisés sont des profils d’expression tissus-spécifiques de 14 des PIP putatives sur P. trichocarpa par qPCR.

1- PIP1

Cette étude nous renseigne sur le lieu préférentiel d’expression des différentes isoformes. On peut ainsi constater que la plupart des PIP qui sont suivies sont plutôt ubiquitaires dans les organes étudiés.

On retrouve systématiquement dans le pool des PIP1 dominantes, l’isoforme PtPIP1-A et PtPIP1-C (Figures 11 A et B). Celles-ci sont exprimées avec une intensité comparable dans les différents organes. L’isoforme PtPIP1-E, qui est moins exprimée est également assez stable dans les tissus étudiés à l’exception de la feuille sénescente où son expression n’est pas détectée. L’isoforme PtPIP1-B, dont l’expression globale est assez stable, semble cependant être légèrement plus exprimée dans la tige avec un maximum observé pour le xylème. L’isoforme PtPIP1-D apparaît comme n’étant pas du tout exprimée au niveau des feuilles. Cette dernière est également absente dans la tige en formation, elle est faiblement exprimée dans les racines et apparaît comme plus spécifique de la tige en croissance et surtout des bourgeons.

Figure 11 : Niveaux d’expression des PtPIP1 chez un P. trichocarpa âgé de 6 semaines par qPCR

Les amplifications ont été réalisées à partir d’ADNc de différents organes de P. trichocarpa dilué au 1/20è en utilisant les amorces du tableau II avec le programme décrit dans la section « matériels et méthodes ».

A- Contribution exprimée en pourcentage de l’expression des différentes PtPIP1 en fonction des organes.

B- Expression relative des PtPIP1 en fonction des organes en unités arbitraires, l’écart type correspond à 4 répétitions des réactions de PCR.

Figure 12. Niveaux d’expression des PtPIP2 chez un P. trichocarpa âgé de 6 semaines par qPCR

Les amplifications ont été réalisées à partir d’ADNc de différents organes de P. trichocarpa dilué au 1/20è en utilisant les amorces du tableau II avec le programme décrit dans la section « matériels et méthodes ».

A- Contribution exprimée en pourcentage de l’expression des différentes PtPIP2 en fonction des organes.

B- Expression relative des PtPIP2 en fonction des organes en unités arbitraires, l’écart-type correspond à 4 répétitions des réactions de PCR.

2- PIP2

PtPIP2-A, PtPIP2-C et PtPIP2-G sont les isoformes les plus fortement exprimées quelques soient les organes considérés et à des niveaux relativement comparables (Figures 12 A et B). PtPIP2-A a une expression plus importante dans la tige où sa contribution notamment dans le xylème où elle représente plus de 20 % de l’expression des PIP2. PtPIP2-D est particulièrement stable entre tous les organes observés. Parmi les 9 PIP2 dont l’expression a été suivie, certaines montrent des profils d’expression plus contrastés. L’isoforme PtPIP2-I est très peu exprimée dans les feuilles et la tige en développement mais relativement abondante dans les bourgeons, la tige en croissance et surtout les racines. Au niveau de la tige, on observe une augmentation des transcrits entre le stade juvénile et le stade adulte où l’on observe des compositions en PIP2 très proches entre xylème et phloème.

3- Au niveau des feuilles

Il est intéressant de remarquer qu’au cours de la croissance des feuilles, on observe une augmentation de l’expression relative de la plupart des transcrits de PIP1 et 2 suivie d’une diminution globale au cours du vieillissement. Ainsi, PtPIP1-A ; B ; E ; et F et PtPIP2-B ; D ; E ; F suivent ce profil d’expression.

Exception faite de PtPIP2-C et I qui sont assez stables au cours de l’ontogenèse de la feuille, l’expression des PIP2 est dynamique. Au cours de la croissance et du développement de la feuille, le pool de transcrits semble augmenter parallèlement avec l’augmentation des activités biologiques.

D’après ces résultats, l’isoforme PtPIP1-D n’est pas exprimée dans les feuilles et PtPIP2-I l’est très peu. Ce genre d’information est important dans la mesure où les travaux qui sont mis en œuvre ont pour objectif de corréler des activités biologiques qui ont lieu dans les feuilles avec l’expression des MIP. L’ensemble des PIP de P. trichocarpa étudiées ont été clonées dans le vecteur p-GEM®T-Easy afin de vérifier par séquençage la spécificité des amplifications mais également en prévision de tests de fonctionnalité dans le système Xenopus laevis. Les gènes candidats à ces tests seront dans un premier temps sous clonés dans le vecteur d’expression T7TS.