Approches d’écophysiologie 1 Mesures de photosynthèse

a- Réponse au CO2

Lors des mesures, la température de la serre était fixée à 20 °C le jour et 18 °C la nuit, sous un éclairage continu de 6 h à 23 h par 4 lampes de 400 W Sylvania Britelux HSI/TSX (Havells Sylvania, Raunheim Germany) offrant 600 µmol.m-2.s-1 à 40 cm de la lampe. Les clones de P. nigra, d’environ 1 m étaient répartis en dessous sur une surface de 2 m2. Les clones P. trichocarpa mesurant 50 cm, ils ont été surélevés de 50 cm pour recevoir une irradiance égale. Cinq à 6 clones de chaque génotype ont été utilisés pour les expérimentations.

Les courbes de réponses au CO2 ont été obtenues grâce au système LI-6400 (LI-COR, Lincoln NE). Le LI-6400 calcule la photosynthèse en analysant par infrarouge la différence de composition entre les gaz contenus dans une chambre où est placé l’échantillon, et une référence (Figure 7). Les valeurs de photosynthèse nette sont obtenues à partir du modèle de Farquhar et al. (1980). Cet appareil permet de contrôler précisément l’ensemble des paramètres qui influent sur la photosynthèse dans une chambre de 6 cm2 où l’on place une partie de la feuille. Une source lumineuse de type LED rouge et bleue placée au dessus de l’échantillon permet de fixer l’irradiance à 1200 µmol.m-2.s-1, valeur non limitante pour le matériel végétal testé. Cette valeur, obtenue expérimentalement lors de travaux préalables de réponse à la lumière effectués sur le même matériel végétal, correspond au début de la saturation de la photosynthèse lors de l’application d’une irradiance croissante. La température de la feuille est fixée à 25 °C et le VPD (Vapor Pressure Deficit) est compris

Figure 8 : Schéma du principe du HPFM

De l’air exerce une pression de 2 Bars (0,2 MPa) sur une solution saline dont le trajet est symbolisé par les flèches et qui est perfusée dans deux feuilles testées en parallèle. Chaque feuille est reliée à un débitmètre (D1 et D2) qui mesure en permanence le flux de solution saline. Les feuilles sont placées dans un bain d’eau « pure » thermostaté à 25°C. Un ordinateur enregistre les valeurs des débitmètres et d’un manomètre afin d’obtenir les valeurs de conductance hydraulique foliaire. Le système permet de mesurer des changements de conductances hydrauliques foliaires au cours de différents traitements ou stimulations. Le schéma montre une stimulation lumineuse des feuilles. Il est possible d’intercaler entre la source lumineuse et les feuilles différentes sortes de filtres. Le système est également utilisable pour mesurer la réponse des feuilles à certains composés en leurs perfusant des solutions directement dans le circuit.

entre 1,2 et 1,6 kPa. Le LI-6400 permettant de contrôler la concentration en CO2 autour de l’échantillon, la concentration initiale est fixée à 350 µmol.mol-1 et la photosynthèse est mesurée. Des paliers sont successivement réalisés à 250, 150, 100, 50, et 600 µmol.mol-1. A partir de 600 µmol.mol-1, la concentration en CO2 a été augmentée par palier de 200 µmol.mol-1 jusqu’à observer une photosynthèse maximale.

b- Calculs des paramètres photosynthétiques

Le Vcmax (vitesse de carboxylation de la Rubisco)et le Jmax (vitesse de transport des électrons) sont estimés à partir d’ajustements des courbes d’assimilation ou photosynthèse (A) en fonction de la concentration en CO2 interne (Ci). Les données sont ajustées à l’aide du logiciel de statistiques R (voir Annexe) suivant les paramètres de Bernacchi et al. (2002) afin d’obtenir deux courbes de régression : la première s’alignant sur les points les plus proches de l’origine, sa pente indique le Vcmax à 25 °C ; la seconde s’alignant sur le plateau de points, sa pente indique le Jmax à 25 °C.

2- Mesure de la conductance hydraulique foliaire

L’appareil utilisé pour réaliser ces mesures est du type HPFM (High Pressure Flow Meter) et a été développé par l’INRA (Figure 8). Il s’agit d’un réservoir de solution saline sous une pression de 0,2 MPa (2 Bars) qui envoie la solution sous pression dans le pétiole de deux feuilles prélevées extemporanément. Les flux de solution saline sont mesurés entre le réservoir et les pétioles par un débitmètre Type E (Brokhorst High Tech, Ruurlo NL). La conductance hydraulique foliaire est calculée en faisant le rapport entre le flux d’eau qui passe par la feuille et par la pression appliquée pour faire passer cette eau. La solution passant à travers la feuille est dégazée afin de diminuer le plus possible la quantité d’air dissous et contient 1 mM de CaCl2 et 10 mM de KCl afin de s’approcher au maximum de la salinité de la sève brute. La feuille à étudier était placée dans un bain d’eau thermostaté à 25°C à moins d’un cm de la surface. La pression et les flux sont enregistrés par ordinateur toutes les 5 secondes.

a– Etude de variations en réponse à la lumière

Placée à 40 cm de la surface de l’eau, une lampe de 400 W Sylvania Britelux HSI/TSX éclaire les feuilles. L’irradiance dans le laboratoire est proche de 0 et est égale à 600 µmol.m-2.s-1 au niveau de la feuille lorsque la lampe est allumée. La différence de réponse

Tableau I : Amorces utilisées pour le clonage des aquaporines

Nom Séquence UTR 5’

Tm (°C) Séquence UTR 3‘ Tm (°C) Taille ADNc (pb) PtPIP1-A AGATCTGATATCCTTTCRCTGTTARCGCTGCA 60 CGTATTGCTATTATTACTTGTGT 48 1067

PtPIP1-B AGATCTGATATCCAAACMANCAACCCATCTTAC 59 TTCAAAAAGCTAGATAATTTACAC 47 1035

PtPIP1-C AGATCTGATATCTAATTGTTWATWCTTAATACTGCG 57 ACGTCACTGTTATAGCACGC 52 1057

PtPIP1-D AGATCTGATATCCAAATACACTTAGCTTAAGCTATAA 59 GAGTAATTTACATAAATGGAACC 48 1155

PtPIP1-E AGATCTGATATCTGACTGAGAAAGGCCAGAGGA 63 AAGAATTCACTGAGAGGGAATA 49 1129

PtPIP2-A AGATCTGATATCACACAGTTACAAGCCGAGAG 62 GTGACGGAGTGAGTAAAAGAGTG 55 1010

PtPIP2-B AGATCTGATATCCATTTCTCCACACTTCCACC 62 AGCTCACAACCATGACATAAC 50 1079

PtPIP2-C AGATCTGATATCCTTTTCTTTGTAAGAAGAACCTA 59 ACCGAAAGGGATAATAAAGGG 50 1023

PtPIP2-D AGATCTGATATCCTCTTCTTCTGTCAACCCTTC 62 CCACCCCACGAGAGAAATC 53 1030

PtPIP2-E AGATCTGATATCCTTTAGCTACCATAACACTTAC 60 ACACATTCCCCAGTTCCAAG 59.8 1047

PtPIP2-F AGATCTGATATCCTACATTTGAAGTTGAGGTAGC 61 ACATAACATGACCCAACTGAG 50 1063

PtPIP2-G AGATCTGATATCCGTCGCAAACCAGTAGCTAG 63 CCGTGACAATGATACACAGCA 52 1093

PtPIP2-H AGATCTGATATCTGCGCTCTAAGAACCACAGAG 63 ACCCACATATCAAGTTGAGAC 50 1026

PtPIP2-I AGATCTGATATCGGAGAAGAAAGATAGTTTGGC 61 GATTCACTTTGCCCACCTTG 52 1134

T7 TAATACGACTCACTATAGGG 48

entre une feuille prise sur une plante non acclimatée à l’obscurité et pour une autre prise sur une plante acclimatée à l’obscurité est mesurée.

b- Recherche d'une régulation endogène de la conductance hydraulique

Afin de mettre en évidence un rythme endogène de régulation de la conductance hydraulique, certaines plantes ont été acclimatées à l’obscurité complète pendant 48 h. Des prélèvements ont été effectués au cours de la journée sur P. nigra (à 8 h, 10 h, 12 h, 14 h et 18 h). Pour chaque point on compare la réponse à la lumière d’une feuille prise sur une plante contrôle non acclimatée à l’obscurité et d’une autre prise sur une plante acclimatée à l’obscurité. Les feuilles ont été choisies pour avoir des surfaces foliaires les plus proches possibles pour chaque prélèvement et chaque échantillon a été prélevé sur le 4ème rang foliaire en partant de l’apex.

c- Etude du rôle de la qualité de la lumière

La lumière est filtrée par un film anti-bleu doublé obtenu auprès de Didier Combes de l’Unité d'Ecophysiologie des Plantes Fourragères (INRA de Lusignan). Le filtre utilisé avec la lampe Sylvania de 400 W laisse passer un rayonnement lumineux de 200 µmol.m-2.s-1 contre 600 µmol.m-2.s-1 sans le filtre à 40 cm de la lampe. La diminution de l’irradiance au niveau de la feuille mesurée sous le filtre rouge est répercutée à la feuille témoin pour laquelle un filtre neutre est appliqué. Ce filtre neutre diminue avec la même intensité toutes les longueurs d’ondes, contrairement à l’anti bleu qui diminue plus fortement les longueurs d’ondes correspondant au bleu que les autres.

III- Approches de biologie moléculaire