comportementale du vieillissement
cognitif des souris Werner
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Introduction :
La progeria de l’adulte a été décrite en 1904 par Otto Werner au sein d’une fratrie de quatre adultes âgés de 31 et 40 ans. Il s’agit d’un prototype des syndromes progéroïdes avec instabilité chromosomique. La progeria de l’adulte ou le syndrome de Werner est une maladie rare dont l’incidence est estimée à 1/1.000.000. Le Japon est le pays avec la plus forte incidence, près de 1/300.000 à cause de la consanguinité (Goto 1981). C’est une affection génétique qui se caractérise principalement par l’apparition à un âge précoce de symptômes ou de maladies associés au vieillissement normal. Les malades sont homozygotes pour une mutation ponctuelle ou une courte délétion dans le gène WRN codant pour une hélicase de type RecQ. Cette hélicase est indispensable au métabolisme de l’ADN et intervient dans de nombreux mécanismes. RecQ participe au processus de réplication (stabilisation de la fourche de réplication), et est aussi impliquée dans la recombinaison homologue et dans la réparation de l’ADN (Lebel, 2001). Cette hélicase intervient aussi dans la résolution des G-quadruplex présents au niveau de l’ADN (Figure 30). La mutation du gène WRN codant pour RecQ entraîne des troubles du système de réparation de l’ADN avec un raccourcissement télomérique du chromosome induisant la sénescence cellulaire. D’autre part, cette mutation a des conséquences moléculaires telles que la perturbation du système ubiquitine/protéasome et le dysfonctionnement de la protéine p53 (Lebel, 2001).
Le phénotype clinique des patients dits Werner est distinctif à partir de l’âge de la puberté puisque ces personnes développent des signes de vieillissement prématuré. Ce phénotype comprend un grisonnement des cheveux ou une calvitie précoce, une peau pseudo- sclérodermique avec des hyperkératoses aux points d’appui, une ostéoporose, une artériosclérose, une cataracte bilatérale, un diabète non insulino-dépendant et un hypogonadisme. Les patients Werner développent des cancers et des maladies cardiovasculaires ce qui entraine leur décès à un âge d’environ 47 ans en moyenne (Epstein et al., 1966). Ce phénotype observé chez les patients Werner est très proche de celui des personnes subissant un vieillissement physiologique normal.
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Figure 30 : Sénescence réplicative prématurée dans les fibroblastes WS : (A) les G- quadruplexs sont normalement déroulés par l'hélicase WRN permettant ainsi de compléter la réplication des télomères. (B) L'absence de WRN provoque des fourches de réplication bloquées sur les sites de quadruplexs G non résolus entraînant un raccourcissement des télomères accéléré. (Shimamoto et al., 2015)
D’un point de vue neuronal, des résultats contradictoires ont été obtenus quant à la présence de plaques amyloïdes dans le cerveau, et de troubles cognitifs chez des personnes atteintes de la progeria (Postiglione et al., 1996, Leverenz et al., 1998, Mori et al., 2003). Chez la souris, Michel Lebel et son équipe ont réussi à modéliser le syndrome de Werner en mutant une hélicase au niveau du gène WRN (Lebel and Leder, 1998). Cette délétion a pour conséquence le développement des symptômes trouvés chez le patient Werner tels que la fibrose cardiaque interstitielle, une augmentation du dépôt de graisse viscérale, une augmentation du taux de triglycérides sanguin à jeun, une augmentation du glucose sanguin et une résistance à l’insuline (Massip et al., 2006). Jusqu’à présent aucune étude cognitive n’a été faite sur ces souris modèles du syndrome de Werner. L’étude cognitive sur ces souris Werner serait intéressante car les études sur le modèle murin en terme de vieillissement restent limitées pour plusieurs raisons, dont le facteur confondant lié à la perte de motricité (Barreto et al., 2010). En effet, la motricité est altérée chez les souris âgées de plus de 18 mois, et une souris qui présente des problèmes moteurs n’est pas un bon modèle pour étudier l’impact du vieillissement sur les processus cognitifs car la plupart des tests exigent que la souris soit capable de se déplacer normalement.
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Par conséquent, le but de cette étude a été de déterminer si les souris WRN pouvaient représenter un nouveau modèle de vieillissement qui présente les déficits cognitifs observés chez les souris âgées mais pas de problèmes moteurs. Dans cette première étude nous avons donc caractérisé le phénotype comportemental des souris WRN au travers de différents tests cognitifs. Pour cela nous avons comparé des souris WRN (fond génétique C57/Bl6) de différents âges (3, 5 et 8 mois) avec les données de la littérature sur des souris âgées de fond génétique C57/Bl6.
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BehaviouralBrain
Research
j o ur na l h o me p a g e :w w w . e l s e v i e r . c o m / l o c a t e / b b r
Researchreport
Cognitivedeficitin
hippocampal-dependenttasks
inWerner
syndromemouse
model
KhaoulaRekika,b,BernardFrancésa,b,PhilippeValeta,c,CédricDraya,c,1,
CédrickFloriana,b,∗,1
aUniversitédeToulouse,France
bCentredeRecherchessurlaCognitionAnimale(CRCA),CentredeBiologieIntégrative(CBI),CNRS,UPS,118routedeNarbonne,F-31062Toulouse,Cedex9,
France
cInstitutNationaldelaSantéetdelaRechercheMédicale(INSERM),U1048,UPS,Toulouse,France
h i g h l i g h t s
•Wernersyndromemiceshowareductioninglucosetoleranceasobservedinagedmice.
•8month-oldWernersyndromemiceshowdeficitinhippocampal-dependentmemory.
•ReversallearningisimpairedinWernersyndromemicemodel.
a r t i c l e i n f o
Articlehistory:
Received29November2016
Receivedinrevisedform16January2017 Accepted18January2017
Availableonline21January2017
Keywords: Wernersyndrome Aging Behavior Memory Mouse a b s t r a c t
Mammalianagingisoftencharacterizedbymetabolicdisturbances,cognitivedeclinesandDNArepairs deficiency,buttheunderlyingmolecularmechanismsarestillnotwellunderstood.AlterationsinDNA repaircansignificantlyexacerbateaging.MammalianneuronalcellswhichaccumulateunrepairedDNA damageovertimecouldpotentiallyleadtobrainfunctionsdisorders.FocusingontheATP-dependent RecQ-typeDNAhelicase,anenzymeinvolvedinrepairofdoublestrandDNA,amousemodelofWerner syndrome(WS)hadbeenproposedasamodelofacceleratedaging.Untilnow,nostudyhasinvestigated theimpactofthisprematureagingsyndromeonlearningandmemory.Spatialmemoryandcognitive flexibilityareparticularlyaffectedbytheagingprocessinbothmenandrodents.Studieshaveshown thatagedmiceexhibitedsimilarperformancethanyoungadultmiceonnon-hippocampusdependent memorywhereastheirperformancesweredecreasedinhippocampus-dependenttasks.Inthisstudy,we havesubmitted3,5and8month-oldWSmicetoseveralbehavioralparadigmstoevaluatehippocampus- dependent(spatialobjectlocation,Morriswatermazeandfearconditioning)andnonhippocampus- dependent(objectrecognition)memories.Noeffectonthelocomotionactivityandanxietylevelhas beenobservedinadultWSmice.Interestingly,the8month-oldWSmiceexhibitlong-termmemory impairmentsimilartoagedmice,suggestingthatadultWSmicedodevelopsomeaspectsofcognitive aging.
©2017ElsevierB.V.Allrightsreserved.
1. Introduction
Agingischaracterizedbyaphysiologicalprocessassociatedwith aprogressivelossoffunctional efficiencyofalltime-dependent organs. Biological aging is often associated with a decrease of physicalperformancesandwithmetabolicdisturbances[1] and cognitive decline [2]. In the case of physiological aging, clear
∗ Correspondingauthorat.CRCA,UniversitéPaulSabatier,CNRS—UMR5169,118 routedeNarbonne,31062ToulouseCedex9,France.
E-mailaddress:cedrick.florian@univ-tlse3.fr(C.Florian).
1 Contributedequally.
metabolicchanges have beenobservedincluding impairedglu- cosetoleranceandtype 2diabetesincrease[3].Spatiallearning andmemoryarecognitivefunctionsmostfrequentlyandseverely impactedwithaging.Indeedspatialmemory,whichismediatedby thehippocampus,undergoesnumerousmolecularandphysiolog- icalchangeswithaging,includingcerebralvasculardegeneration, decreased glucose utilization and bioenergetic metabolism [4]. Consistentwithcognitivedecline,atypicalsynapsemorphology, aberrantproteinandneurotransmittersynthesishavebeenshown withadvancing age [5]. Interestingly, studieshave shown that agedmiceexhibitedsimilarperformancethanyoungadultmice onnon-hippocampusdependentmemory(i.e.,objectrecognition), whereastheirperformancesweredecreased ina hippocampus- http://dx.doi.org/10.1016/j.bbr.2017.01.034
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dependantobjectlocationtask[6].Moreover,theperformanceof 18 month-oldmiceshowed reduced motor skillsand impaired motorcoordinationincomparisontoyoungmice[7].Finally,aged mice spentsignificantly less time in the open armsof an ele- vatedplus mazethan adultmice,suggesting a role ofaging in anxiety-relatedbehavior[8].Overall,wecannotexcludethatsome ofcognitivedeclinesobservedduringaginginmicecouldbedue toanxietyincreaseand/orlocomotionalteration.
Agingisalsoknowntobeassociated withDNA damageand altereddouble-strandbreak(DSB)repairsystems[9,10].Fewstud- ieshaveestablisheda directlinkbetweendefectinDNA repair andcognitivedeficitduringaging.Usinga mousewithamuta- tioninthegeneinvolvedinDNArepairpathway(excisionrepair cross-complementing group1, Ercc1), Borgesius and colleagues haveshownthatunrepairedDNAdamageiscorrelatedwithage- dependentcognitivedeclineandhippocampalsynapticplasticity deficit[11].Morerecently,alteredDSBrepairsystemshasbeenpro- posedasamainfactorresponsibleoflearningandmemorydeficit inanAlzheimer’sdiseasemicemodel[12].Moreover,alteredDNA repairsystemsmightcontributetocognitivedeclinebyregulating theexpressionofsetofgenesinvolvedinlearningandmemory [13].Altogether,thesestudiessuggestarelationshipbetweenDNA damage,memorydeficitandaging.
Mostprematureagingsyndromes,asWernersyndrome(WS), arecausedbymutationsingenesencodingproteinsinvolvedin DNArepair,asDNAhelicases[14].WSisanautosomalrecessive diseasecharacterizedbyearlyonsetofmanysignsofnormalaging [15]. The gene responsible for WS wasidentified by positional cloningandthegeneproductcontainsadomainhomologousto theRecQ-typeDNAhelicasesinvolvedinrepairofdoublestrand DNA[16].InWS,telomeredysfunctioniscausaltotheaccumu- lationofDNAdamagefociandresultsinprematuresenescence. Veryfewlittleisknownonthepossibleprematureagingofthe centralnervoussysteminWS[17].Normalbrainmorphologyand functionshavebeendescribedintwopatientswithWSconfirming thebelievethatsegmentalprematureagingsparesthecentralner- voussystem[17].However,Leverenzandcollaboratorshaveshown extensiveamyloiddepositsinfrontalcortex,temporalcortexand hippocampusina57year-oldpatientwithWS[18]butitisdifficult toconcludesincethispatientcarriesalsotheapolipoprotein(apo) E4,thestrongriskfactorforAD[19].Incontrast,adeletionmuta- tionofWRNgeneina55year-oldpatientshowednoassociation withcentralnervoussystempathology,suchasamyloidplaques [19].HoweverbecauseoftherarityofWSpatients,theimpactof anacceleratedaginginbrainfunctionsstillneedstobeestablished. Mice lacking the helicase domain exhibit many features of WS,includingapro-oxidantstatusandashortermeanlifespan [20].MoreovertheseWSmicedevelopedseverecardiacinterstitial fibrosisinadditiontotumorsandothersymptomsfoundinpatients withWS[21].Asasegmentalprogeroidsyndrome,WSdoesnot exhibitallofthefeaturesofnormalagingbutneverthelessisavery usefulmodelsystemforthebehavioralandmolecularstudyofnor- malaging.Therefore,toaddressthequestionwhetheraccelerated aginginWSaffectsthecentralnervoussystem,weinvestigatedthe consequencesofWRNgenemutationoncognitivecharacteristics inWSmice.Hence,thefirstaimofourstudywastocharacterize metabolicandbehavioralprofilesofWRNdeficiencymicefocusing onmetabolicdysfunction,locomotion,anxiety,andmemory.
2. Materialsandmethods
2.1. Subjects
MicelackingpartofthehelicasedomainoftheWRNgenewere generatedbyhomologousrecombinationaspreviouslydescribed
[20]. Briefly, 121amino acidresiduesof theWrnprotein were deletedin homozygous Wrnhel/hel mice.Initially,the genetic background of these mice was both 129/Sv and Black Swiss. Wrnhel/helmicewereatleast12-foldbackcrossedtoaninbred C57Bl/6background.OnlyfemalehomozygousWrnhel/helmice at 3, 5 and 8 month-old of agewere used in behavioral stud- ies.The3month-oldmicewereusedascontrol.Bothmaleand femaleC57Bl/6andhomozygousWrnhel/helmicewereusedfor themetabolismstudy.Theywerehousedinacollectivecage(5–6 percage)inaroomwithcontrolledtemperature(21–23◦C),and a12-hlight/darkcycle.Foodandwaterwereprovidedadlibitum. Allexperimentswereperformedinstrictaccordancewiththerec- ommendationsof TheEuropeanCommunitiesCouncil Directive (86/609/EEC), TheFrenchNationalCommittee(87/848)and the guidefortheCareandUseofLaboratoryAnimalsoftheNational InstitutesofHealth(NIHpublicationno.85–23).Inapplicationof theEuropeandirective2010/63/UEandaccordingtotheongoing Frenchlegislationatthetimeofexperiments,nospecificapproval wasnecessaryforthisstudy.
2.2. Metabolicanalysis 2.2.1. Glucosetolerancetest
Cohortsofmiceatdifferentageswerestarvedfor6handthen weighed.Baselinebloodglucosewasmeasuredbytailveinbleed- ingusingaOneTouchglucosemeter(Accu-chek®).Asingledose of20%D-glucoseinsaline(1g/kgbodyweight)wasadministered intraperitoneally(t0),whichwasfollowedbysamplingbloodat differenttimepoints(t15–t90)tomeasurebloodglucose. 2.3. Behavioraltestings
2.3.1. Locomotorandanxiety-relatedbehaviors
Locomotor activity was recorded in a Plexiglas chamber (25×21.5×9.5cm)equippedwithinfraredphotobeams(Apelex, Evry,France).Horizontalandverticalactivitiesweremeasuredas thetotalnumberofphotobeambreaksper15minovera1hperiod, startingat12:00hP.M.Tomeasureanxiety-relatedbehavior,mice weresubmittedtoanelevated-plusmaze.Thismazeconsistedof aplus-shapedtrackwith2closedandopenarms(30×10×20cm) thatextendedfromacentralplatform(10×10cm).Theappara- tuswaselevated50cmabovethefloorandwassurroundedbya whitecurtainwithoutanyconspicuouscues.Eachtrialbeganwhen themousewasplacedinthecentralzoneandlasted5min.The numberofentriesintoclosedandopenarmsandthetimespentin eacharmweremonitored.Themazewascleanedwith70%ethanol betweeneachmousetoremoveolfactorycues.Mousebehaviorwas videotapedandanalyzedusingethologicalsoftware.
2.3.2. Objectlocationandobjectrecognitionmemorytask
Objectmemorytaskswereperformedinacirculararena(height: 30cm; diameter: 40cm) and placed in a room containing no conspicuousfeatures,illuminatedbyawhitelight(60W)andsur- mountedbyavideocameraconnectedtoavideorecorderanda monitor.Thedaybeforetraining,miceweresubmittedtoa10-min sessionconsistingtoacontexthabituationperiodwithoutobjects inthearena.Duringthetrainingday,micewereplacedinthesame arenawith2identicalobjects,i.e.agreenglassPago®bottle(height: 12.9cm;diameter: 5.8cm)andtheirweightwassuchthatthey couldnotbedisplacedbyanimals.24hafterthe10-mintraining, onegroupofmicewassubmittedtoa10-mintestingsessioninthe originaltrainingarenainwhichonlyoneofthetwoobjectswas movedtoanewlocation.Theothergroupofmicewassubmitted toa10-mintestingsessioninthetrainingarenainwhichafamiliar objectandanewobject,i.e.,awhiteglasscylinder(height:7cm; diameter:6cm)insertedonasquareplasticbase(7×7cm)were
70 K.Rekiketal./BehaviouralBrainResearch323(2017)68–77
locatedatthesameplaceusedduringtrainingday.Explorationof theobjectswasdefinedastheamountoftimemicetouchedthe objectswiththeirnoseoranteriorpaws,andwasscoredmanually byanexperimenterblindtoageofmice.
2.3.3. SpatialandreversallearninginMorriswatermazetask TheMorriswatermazeconsistedinaswimmingcircularpool (height:30cm;diameter:110cm)filledtoadepthof15cmwith watertemperaturemaintainedat23±1◦C.Thewaterwasmade opaquebyadditionofawhitenontoxicopacifier.Awhitepainted platform(diameter:9cm)wasplacedinsidethepool,15.5cmaway fromthepoolwall.Severalextramazevisualcueswereattached tothewallsoftheexperimentalroom.Fourstartpositionswere locatedaroundtheperimeterofthepool,dividingitssurfaceinto fourequalquadrants.Atday1,micewereindividuallysubmitted toasinglepre-trainingsession(Familiarization)consistingofthree trialswithavisibleplatformthatprotruded0.5cmabovethesur- faceofthewaterandwasalwayslocatedatthesamelocation.At thebeginningofeachtrial,micewereplacedinthemazefacingthe wallatoneofthedifferentstartinglocations.Micewereallowed toswimfreelyuntiltheyreachedtheplatform.Anymousethatdid notfindtheplatformwithin60swasgentlyguidedtoit bythe experimenter.Aftertheanimalshadclimbedontotheplatform, theywereallowedtoremainonitforanadditional60s.Thestart- ingpositionsweredeterminedinapseudorandomorder,suchthat eachwasusedonceinasinglesession.Nextday,miceweresubmit- tedto6consecutivetrainingdays(day2today7)with3trialsaday. Latenciestoreachthehiddenplatform(platformwassubmerged 0.5cmbeneaththesurfaceofthewater)locatedinthesamequad- rant(named“target1”)wererecordedbyvideotrackingsystem (EthovisonXT®,Noldus,Netherlands).Duringtheprobetrial(day 8),theplatformwasremovedandmice,startingfromthecenterof thepool,werealloweda60-ssearchfortheplatform.Timespentin eachquadrantwasscored.Then,miceweresubmittedtotwodays ofareversallearningconsistingof3trialswheretheplatformwas placedtothenewlocation(named“target2”).Twenty-fourhours afterthefinalreversaltrial,theplatformwasremovedandthemice weregivenprobetrialsasdescribedabove.
2.3.4. Contextualfearconditioningparadigm
Trainingandtestingofcontextualfearconditioningoccurred inrectangularpolyvinylchloridebox(length35cm,width20cm andheight25cm).Chamberfloorwasstainlesssteelrods(diameter 4mm)spaced1cmapartconnectedtoashockgenerator(Campden Instruments,UK).Theexperimentaldevicewaslitbya60Wwhite bulb.Experimentswererecordedbyavideocameraplacedinfront oftheconditioningchamber,andconnectedtoaTVmonitoranda videotaperecorderintheadjacentroom,wheretheexperimenter andalltheelectronicsystemweresettled.Forallbehavioralpro- cedures,freezing(definedasthelackofallmovementasidefrom respiration)servedasthedependentmeasure,andwasassessed usingatimesamplingprocedure:micewereobservedfor1severy 5sandscoredaseitherfreezingoractive.Theconditioningcham- berwascleanedwith70%ethanolbeforeeachanimal’straining session.Briefly,micewereplacedintotheconditioningchamber andwereallowedtoexplorefora120-sbaselineperiodbeforeto receivea2-s,0.70-mAfootshock.Thefirstfootshockwasfollowed byanotherone120slater.Miceremainedinthechambers30s afterthesecondfootshockbeforebeingremovedfromtheirhome cage.Twenty-fourhoursafterconditioning,micewereindividu- allycheckedforfreezingbehaviortothetrainingcontextfor4min. Threehourslater,miceweresubmittedtoamodifiedcontextcon- sistinginatriangularchamber,withwhitePlexiglaswallsandfloor. Aloudspeakerproducingan85dBtonewasfixedonthetopofthe
chamber.Thenewchamberwaswashedwith1%aceticacidandlit bya40Wredbulb.Freezingwasmeasuredasdescribedabove. 2.4. Statisticalanalysis
Data wereanalyzed using GraphPadPrism Program(Graph- PadSoftware,Inc.,SanDiego,CA,version,5.01).Dataweretested fornormalityusingShapiro-Wilknormalitytestandexpressedas means±standarderrorofmeans(SEM).Thetrapezoidalrulewas usedtodeterminetheareaunderthecurve(AUC).Locomotoractiv- ityand training inMorris watermazetaskwereanalyzedby a two-wayANOVAtestwithrepeatedmeasures.Inplusmazeand fearconditioningtasksweusedone-wayANOVA.Inobjectrecogni- tionandobjectlocationstasks,tocomparetheindiceofpreference