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2.1- CADRE
2.1.1- Cadre institutionnel
La formation en biologie médicale suivie s’est déroulée à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC) sise à l’Université d’Abomey-Calavi (UAC). Cette école dispense des formations aussi bien dans le secteur industriel que celui biologique qui renferme la filière de Génie de Biologie Humaine (GBH).
2.1.2- Cadres techniques
Les expérimentations ont été faites au :
- Centre Hospitalier Universitaire Départemental de l’Ouémé/Plateau (CHUD-OP) - laboratoire du service départemental de transfusion sanguine Ouémé/Plateau Présentation du cadre technique du CHUD-OP:
Le CHUD-OP est situé dans le département de l’Ouémé précisément à Porto-Novo, dans le quartier Ouenlinda. Il est implanté sur une superficie de 5,6 hectares et en tant qu’hôpital départemental de référence suivant la pyramide sanitaire, il dessert les populations de l’Ouémé et du Plateau. Le CHUD-OP abrite en son sein plusieurs services de soins que sont entre autres : la banque de sang, la chirurgie, le laboratoire, la maternité, la médecine interne, l’ophtalmologie, la pédiatrie-néonatologie, la pharmacie, la radiologie, les soins intensifs, le service social, le service d’ORL, le service de rééducation, les services de l’administration, les urgences.
Le laboratoire du CHUD-OP regroupe les sections suivantes : la bactériologie, la biochimie, la sérologie, l’hématologie-parasitologie, les urgences.
Dans la section sérologie sont réalisés les examens suivants : le sérodiagnostic de Félix et Widal, le sérodiagnostic de la syphilis, les sérodiagnostics de la rubéole, de la chlamydiose, de la toxoplasmose, la recherche et le dosage de la protéine C-Réactive, la recherche de l’antigène du virus de l’hépatite B, la recherche et le dosage de l’anticorps anti-streptolysine O, l’électrophorèse de l’hémoglobine, l’électrophorèse des protéines.
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2.2- MATERIEL
2.2.1- Matériel biologique
L’étude a été réalisée sur 30 séra de différents patients venus pour le diagnostic de l’hépatite B.
2.2.2- Equipements et autres matériels :
Les expérimentations ont nécessités : des portoirs, une centrifugeuse de paillasse, des cassettes du TDR, une minuterie, des marqueurs, une poubelle, des tubes Epindofs, des micropipettes réglables, un agitateur Vortex, des microplaques, un laveur ELISA de la marque BIO RAD, un lecteur ELISA de la marque BIO RAD (PR 3100 TSC), des pipettes Pasteur, des cônes bleu et jaune, une boîte de gants, un congélateur, un incubateur de la marque BIO RAD IPS et une imprimante de la marque Canon.
2.3- METHODES
2.3.1- Type et période d’étude
Il s’agissait d’une étude prospective, transversale à visée analytique qui s’est déroulée du 11 juillet au 30 septembre 2016.
2.3.2- Population d’étude
La sélection des prélèvements a été l’une des étapes les plus précieuses. Les prélèvements recueillis étaient ceux de sujets s’étant présentés au laboratoire d’analyses biomédicales du CHUD-OP avec une demande d’examen en vue d’une recherche de l’antigène du VHB.
Etaient inclus tous les sujets venus avec une demande d’examen remplie par un médecin.
Tous les sujets venus de leur chef et ceux sous traitement ont été exclus de l’étude.
2.3.3- Echantillonnage
La taille a été fixée à 30 échantillons à cause des informations reçues de certains biotechnologistes par rapport aux divergences observées entre les résultats obtenus avec les TDR et ceux obtenus avec la technique ELISA. Pour collecter les échantillons, nous avons d’abord
Réalisé et soutenu par LATE LAWSON Ange Page 14 remis un formulaire d’enquête à remplir à tous les sujets venus dans le laboratoire avec une demande d’examen, en vue de la recherche de l’antigène du VHB, remplie par un médecin. Nous avons, ensuite, fait un tri des formulaires. A l’issu de ce tri, nous avons éliminé les sujets dont les formulaires ne sont pas bien remplis. Nous avons arrêté l’échantillonnage une fois les 30 échantillons rassemblés.
2.3.4- Méthodes analytiques
Les échantillons ont été collectés au laboratoire d’analyses biomédicales du CHUD-OP.
Les renseignements qui suivent : date, centre de santé de provenance, N° d’ordre du patient, nom et prénoms, sexe, âge, test de diagnostic réalisé (et son résultat) et le test de référence réalisé (et son résultat) ont été recensés sur chaque sujet au moyen d’un formulaire d’enquête pendant la période du 11 juillet au 30 septembre 2016. Les TDR sur cassette ont été réalisés sur tous les séra de chaque journée puis ceux-ci ont été aliquotés et conservés à -20°C. A la fin de l’échantillonnage, les séra sélectionnés ont été transportés, dans une glacière contenant des accumulateurs de froid, au laboratoire de Transfusion Sanguine de l’Ouémé/Plateau et un test de référence en occurrence l’ELISA a été réalisé sur ces séra. Les résultats obtenus avec les TDR ont été comparés à ceux obtenus avec l’ELISA afin de déterminer les performances de ces TDR.
2.3.4.1- Tests de Diagnostic Rapide (TDR) : SD BIOLINE HBsAg Lors de cette étude, les TDR ont été réalisés sur cassette.
Principe :
Le test est basé sur le principe d’un test d’immunochromatographie in vitro pour la détection de l’AgHBs. Lorsque l’échantillon à tester est déposé dans le réservoir à spécimen de la cassette, on assiste à une migration. Si l'AgHBs est présent, il se lie avec l’anticorps conjugué anti-AgHBs marqué à l'or colloïdal. Sous l'effet d'un tampon, les complexes antigènes-anticorps migrent par capillarité et sont arrêtés par des anticorps de capture fixés sur la membrane. Un résultat positif se traduit par l'apparition d'une ligne colorée. L'excès de complexe conjugué continue à migrer et est immobilisé par un anticorps (anti-lapin ou anti-souris), l'accumulation des complexes colorés entraîne l'apparition d'une ligne colorée, cette seconde ligne ou ligne de contrôle valide le bon fonctionnement de la réaction.
Réalisé et soutenu par LATE LAWSON Ange Page 15 Mode opératoire
Etape pré - analytique :
Nous nous sommes mis dans les conditions de manipulation (port de la blouse et des gants) et avons désinfecté le poste de travail. Après cela, nous avons fait sortir les kits de TDR du réfrigérateur et les avons laissés à température ambiante sur la paillasse pendant 20 minutes.
Etape analytique :
Pour chaque échantillon, nous avons retiré le dispositif de test (la cassette) de la pochette scellée et l’avons posé sur la paillasse. Ensuite, nous avons étiqueté la cassette avec le numéro d’identification du sujet et avons mis 100μl de sérum à l’aide d’une micropipette dans le
Négatif : L’apparition d’une seule ligne témoin de couleur rouge dans la zone Contrôle (C) en l’absence de ligne de couleur dans la zone Test (T) indique un résultat négatif.
Positif : L’apparition de deux lignes de couleur rouge, une dans la zone Test (T) et une dans la zone Contrôle (C) indique un résultat positif.
Indéterminé : Une ligne témoin rouge doit toujours apparaître dans la zone Contrôle, que la ligne Test apparaisse ou non. Si aucune ligne rouge distincte n’est visible dans la zone Contrôle, le test n’a pas été exécuté convenablement. Dans ce cas, il faut vérifier la méthode de test et répéter le test avec une nouvelle cassette.
Etape post analytique :
Nous avons éliminé tous les déchets contaminants comme les échantillons de patients et les dispositifs utilisés dans la poubelle prévue à cet effet. Par la suite, les agents qui sont habilités à gérer ces types de déchets en ont pris la charge.
Réalisé et soutenu par LATE LAWSON Ange Page 16 2.3.4.2-Test ELISA Monolisa HBs Ag ULTRA
Principe : C’est une technique immuno-enzymatique de type "sandwich" en 1 temps utilisant des anticorps monoclonaux et des anticorps polyclonaux sélectionnés pour leur capacité à se lier aux différents sous-types de l'AgHBs actuellement reconnus par l'OMS et la plupart des souches variantes de l’hépatite B.
La phase solide de Monolisa HBs Ag ULTRA est sensibilisée avec des anticorps monoclonaux.
Les conjugués de Monolisa HBs Ag ULTRA sont basés sur l’utilisation des anticorps monoclonaux de souris et des anticorps polyclonaux de chèvre contre l’Ag HBs. Ces anticorps sont couplés à la peroxydase.
Mode opératoire
Phase pré - analytique
Avant la mise en œuvre de la technique ELISA, nous avons nettoyé le poste de travail et sorti le KIT à utiliser ainsi que les échantillons du réfrigérateur. Nous avons, ensuite, apprêté le matériel, établit le plan de distribution et d’identification des échantillons tout en s’assurant que les échantillons ainsi que les réactifs restent à température ambiante pendant environ 60 minutes.
Après cela, nous avons préparé la solution de lavage, celle de conjugué et celle de la révélation enzymatique.
Préparation de la solution de lavage : Nous avons réalisé une dilution au 1/20e de la solution de lavage concentrée (Tampon tris, NaCI, pH = 7,4) dans de l’eau distillée.
Préparation de la solution de conjugué : Nous avons tapé doucement le flacon de conjugué lyophilisé (Anticorps monoclonaux HBs de souris et anticorps polyclonaux anti-HBs de chèvre couplés à la peroxydase) sur la paillasse pour détacher toute substance pouvant adhérer au bouchon de caoutchouc puis nous avons ouvert le flacon de conjugué lyophilisé et y avons transvasé le contenu d'un flacon de diluant pour conjugué (Tampon Tris HCl, contenant de la SAB, additionné d'un mélange d’AgHBs purifiés des sous-types ad et ay, humains). Pour finir, nous avons rebouché et laissé reposer 10 minutes en homogénéisant de temps en temps pour faciliter la dissolution.
Préparation de la solution de révélation enzymatique : Nous avons dilué la solution de chromogène (solution de tétraméthyl benzidine/TMB) dans le tampon substrat de la peroxydase
Réalisé et soutenu par LATE LAWSON Ange Page 17 (solution d’acide citrique et d’acétate de sodium de pH 4,0 contenant 0,015% d'H2O2) au 1/11ème.
Phase analytique
Nous avons déposé 100µl de contrôle négatif, de contrôle positif et des séra à tester dans les puits prévus pour cela comme planifié dans le plan de travail et avons ajouté 50µl de la solution de conjugué après l’avoir bien homogénéisée (les puits sont colorés en rouge à cause de la couleur rouge de la solution de conjugué). Après mélange, nous avons recouvert la microplaque d’un film adhésif et l’avons incubé pendant 90 minutes à 37°C. Après l’incubation, nous avons retiré le film adhésif et avons lavé 5 fois le contenu de chaque puits. Nous avons veillez à ce que le volume résiduel soit de 10µl dans chaque puits. Ensuite, nous avons rajouté 100µl de la solution de révélation enzymatique (les puits ont une coloration rose) et avons mis la microplaque à l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes. Enfin, nous avons procédé à la lecture. Lorsque le puits est coloré en rose, il s’agit d’un résultat négatif et lorsqu’il est coloré en bleu, il s’agit d’un résultat positif.
Phase post analytique :
Nous avons éliminé tous les déchets contaminants comme les échantillons de patients et les dispositifs utilisés dans la poubelle prévue à cette fin. Les agents qui sont habilités à gérer ces types de déchets les prennent en charge, dès que possible.
Performance caractéristique du Kit Monolisa HBs Ag ULTRA:
La sensibilité et la spécificité de ce kit s’élèvent à 100%.
2.3.5- Méthodes statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel Microsoft Excel 2007 et du logiciel épiInfo. Les fréquences ont été calculées pour apprécier la distribution des variables et pour calculer la sensibilité, la spécificité ainsi que les valeurs prédictives.
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