DEUXIEME PARTIE
Cadre, Matériel et Méthodes
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21 2.1- Cadre de travail
2.1-1. Cadre institutionnel
Notre formation s’est déroulé au Centre Autonome de Perfectionnement (CAP), Département de Génie de Biologie Humaine plus précisément l’Ecole Polytechnique de Abomey Calavi ou nous avons eu a suivre notre formation pendant 4 ans.
2.1-2. Cadre technique
Notre étude s’est déroulée dans le centre de santé de la commune (CS Com) de Parakou.
2.1-2.1. Présentation du CS Com et organisation des services 2.1-1.1.1. Situation géographique
Le CS Com de Parakou est situé dans le 2ème arrondissement de la ville de Parakou au quartier Ladji Farani en face de la bibliothèque départementale. A sa gauche se trouve l’Africaine des Assurance à droite on trouve la centrale d’achat des médicaments essentiels (CAME), au nord se trouve le commissariat central de Police. Il se situe sur la voie pavé e allant à l’Institut Français vers le CAS.
2.1-1.1.2. Organigramme du CS Com
Le centre de santé communal comprend plusieurs unités techniques à savoir :
Le dispensaire
Le service de vaccination
La maternité
La pharmacie
Le centre de dépistage de la tuberculose (CDT)
Le service d’hygiène et assainissement
La comptabilité et gestion
L’administration et
Le laboratoire d’analyses médicales service dans lequel nous avons effectué nos recherches.
2.1-2.2. Description du laboratoire
Le laboratoire se trouve dans le bâtiment à droite en entrant dans le cantre plus précisément dans le deuxième couloir, à la troisième porte. Il est constitué d’une seule pièce qui contient en même temps le bureau.
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22 A l’intérieur de la salle se trouve une grande paillasse où se font les examens hématologiques, biochimiques, parasitologiques et sérologiques
Le personnel du laboratoire constitué de 3 techniciens et d’un aide soignant qui assurent les tâches quotidiennes du service.
2.1-2.2.1. Equipement du laboratoire
Le laboratoire cotient les appareils et équipements suivants :
Une centrifugeuse à tube
Une centrifugeuse à hématocrite
Un réfrigérateur
Un bain marie
Un agitateur rotatif électrique
Un chariot
Un automate hématologique de marque RAYTO. Ce dernier nous à permis d’avoir plus aisément les résultats hématologiques des enfants.
2.1-2.2.2. Les examens réalisés dans le laboratoire
Dans chacune des sections du laboratoire, les examens suivants sont réalisés.
Section hématologique
Test d’Emmel
Numération Formule Sanguine
Vitesse de sédimentation Section parasitologique
GE-DP Goutte Epaisse et Densité Parasitaire
AKOP Amibe Kyste Œuf et Parasite
Recherche d’œuf de schistosome
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23 Section sérologique
Sérodiagnostic de Widal (SDW)
Antistreptolysine O (ASLO)
Test HIV
Test des hépatites B et C
Treponema Pallidum Hemagglutination Assay (TPHA)
Rapid Plasma reagin (RPR)
Examen Cytobactériologique des Urines (ECBU) simple
Recherche de Bacille Acido- Alcoolo Résistant (BAAR) 2.2- Matériel d’étude
2.2-1. Consommables de laboratoire
Dans le cadre de nos travaux, les consommables de laboratoires suivants ont été utilisés
De coton hydrophile
Une pissette d’alcool iodé à 60 °C
Un garrot
Des aiguilles vacutenair et des vaccinostyles selon le cas
Des tubes à anticoagulants EDTA
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Des gants
Un portoir
Un marqueur
Un stylo
Des lames
Des lamelles
Du compresse
Des cônes jaunes
Des micropipettes P1000 et P50 2.2-2. Réactifs
Du méthanol
Solution de Drabkin
Solution de Giemsa diluée au dixième 2.2-3. Le gros matériel
Un automate hématologique Rayto 7600
Un microscope
Spectrophotomètre 2.2-4. Echantillonnage
Notre étude à porté sur 210 enfants de moins de 15 ans reçus au laboratoire dans le cadre d’une NFS et soupçon de paludisme. Ils ont été retenus de façon exhaustive au fur et à mesure pendant la période d’étude.
Critères d’inclusion
Sont inclus dans cette étude, tous les patients admis au centre de santé communal de Parakou et prélevé au laboratoire remplissant les conditions suivantes :
Agés de moins de 15ans
Dont la goutte épaisse est positive
Dont la NFS est faite
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Critères de non inclusion
Ne sont pas pris en compte dans cette étude les enfants dont :
La goutte épaisse est négative
Il s’agit d’une étude prospective. Elle est de type transversal, descriptive à visée analytique.
Elle s’est déroulée sur une durée de 6 mois couvrant de Juillet à Novembre 2017.
2.3-2. Méthode de réalisation des techniques de laboratoire
Sur chaque échantillon de sang prélevé, nous réalisons systématiquement la Numération Formule Sanguine sur l’automate hématologique. Néanmoins certains paramètres comme l’hémoglobine et l’hématocrite sont confirmés manuellement en cas de discordance ressentie dans les résultats. Après cela la goutte épaisse et frottis sanguin sont réalisés.
2.3-2.1. Protocole de réalisation du prélèvement sanguin
Prélèvement veineux
Identifie le tube de prélèvement (nom, prénom, examen à effectuée, n°d’identification)
Installer le patient
Plier la marche de sa chemise (si nécessaire)
Placer le garrot au niveau de l’avant-bras
Rechercher et choisi la veine à ponctionner
Fait un tampon d’alcool iodé, puis désinfecter correctement la partie de la peau où on désire faire la ponction
Déposer le tampon d’alcool utilise dans le plateau
Sortir l’aiguille de son emballage et l’adapter au corps vacutainer
Retire le couvercle de protection de l’aiguille, et le déposer sur la table de prélèvement, puis sans attendre 5s au plus, réaliser la ponction
Recueillir la quantité de sang suffisante à l’analyse qu’on désire effectuer
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Détacher le garrot
Placer le tampon de coton au niveau de la partie ponctionnée
Retirer délicatement l’aiguille et appuyer fortement le tampon sur la partie ponctionnée avec le pouce de la main libre
Demander ensuite au patient d’appuyer à son tour sur le tampon
Jeter aussitôt l’aiguille dans la boite de sécurité et boucher rapidement le tube de prélèvement avec le bouchon
Homogénéiser aussitôt le prélèvement par retournement successif jusqu’à dilution complète de l’anticoagulant
Dépose l’échantillon dans le portoir
Prélever un petit tampon d’alcool simple et le remplacer par le précédant tampon d’alcool iode
Garde ce dernier tampon jusqu’à l’arrêt du saignement
Mettre un pansement
libérer le patient
jeter les déchets (tampon, …) dans la poubelle jaune
respecter les règles d’hygiènes et le port des gants 2.3-2.2. Réalisation de la goutte et du frottis sanguin . Frottis sanguin
Mettre une première goutte de sang (environ 3µL) au milieu de la lame
Déposer la lamelle sur la goutte de sang. Le sang s’étale par capillarité
Porter la lamelle vers l’autre extrémité en maintenant la lamelle au contact avec la lame d’un mouvement continu régulier et rectiligne
Laisser sécher
Goutte épaisse
Après avoir déposer la deuxième goutte de sang (environ 5 à 10µL) au niveau du quart supérieur de la lame en tenant compte du frottis,
Prendre une autre lame puis étaler le sang en faisant des ronds concentriques du centre vers l’extérieur de 1cm de diamètre en s’assurant qu’elle soit uniforme.
Le frottis et la goutte épaisse doivent être sur la même lame, faire l’identification sur le frottis ou sur la partie destinée a l’identification comme l’indique la figure 7.
Tout ceci est fait en respectant les règles d’hygiènes au laboratoire et le port des gants.
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Figure 7 : Goutte épaisse et frottis sanguin confectionnées sur une lame 2.3-2.3. Coloration
Après avoir laissé sécher le frottis et la goutte épaisse à la température ambiante du laboratoire,
Fixer le frottis avec le Méthanol
Sécher 1 à 3 min
Déshémoglobiniser avec de l’eau de robinet la goutte épaisse
Laisser sécher 5 à 10 min
Tremper la lame dans le Giemsa dilué au 1/10 pendant 10 à 15 min
Rincer en trempant 2 à 3 fois dans l’eau
Laisser sécher à la température ambiante du laboratoire
Passer à la lecture au microscope optique.
2.3-2.4. Lecture et comptage
Lecture
La lecture se fait à l’objectif х100. On fait la densité parasitaire sur la goutte épaisse et l’identification de l’espèce plasmodiale sur le frottis.
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Comptage
Cas négatif
Comptage au moins 500 globules blancs ou parcourir 100 champs avant de déclarer la lame négatif.
Cas positif
Compter jusqu’à 200 leucocytes si parasites ≥ 100 et calculer la densité parasitaire
Si parasite < 100, compter jusqu’à 500 leucocytes avant de calculer la densité
Compter les globules blancs dans tout le champ. Répéter la même chose dans 10 champs.
Puis calculer la densité parasitaire
Nombre de parasite x 4 x NGB/mm3 de sang
2.4-3. Opérationnalisation des variables
Anémie
Dans notre étude les types d’anémie ont été définis comme suite :
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Lorsque le taux d’hémoglobine est inférieur à 12 g/dl on parlera d’anémie (Hb
<12g/dl)
anémie microcytaire : une anémie est dite microcytaire lorsque le taux d’hémoglobine Hb <12g/dl et le volume moyen globulaire V.G.M inférieur à 75fl (Hb < 12g/dl +V.G.M inférieur à 75fl).
anémie hypochrome : une anémie est dite hypochrome lorsque le taux d’hémoglobine Hb < 11g/dl et la concentration moyenne en hémoglobine
C.C.M.H < 30 g/dl et/ou la teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine T.C.M.H
<27pg/cellule (Hb < 11g/dl+ C.C.M.H< 30 g/dl et/ou T.C.M.H < 27pg/cellule).
- anémie sévère : lorsque le taux d’hémoglobine est inférieur à 5 g/dl [16].
2.5- Analyse des données
Nos données ont été enregistrées dans le logiciel Excel 2010 et traités par le logiciel Epi info 7. Nous avons calculé les fréquences des variables et le seuil de signification avec un risque d’erreur alpha égal à 5% (α= 0,05) pour un intervalle de confiance IC à 95%. La valeur P<
0,05 à été considérée comme significative.
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