C.2) La protéine Sonic Hedgehog

Afin d’optimiser le potentiel des ASC par thérapie génique transitoire, la protéine Sonic Hedgehog (Shh) a été choisie comme première protéine candidate.

III.C.2.a) Description

Un morphogène est un gène exprimé pendant le développement embryonnaire et codant pour une protéine dont le gradient induit la formation des axes et des polarités de l’embryon.

La protéine Sonic Hedgehog (Shh) est codée par un morphogène du même nom présent sur le chromosome 7 (7q36). Elle a été découverte en 1978 par Wieschaus E, et Nusslein-Vohlard C. lors d’études sur le développement embryonnaire de la Drosophila melanogaster (Nusslein-Vohlard and Wieschaus, 1980). Ces travaux sont à l’origine de la découverte de la famille des morphogènes Hedgehog qui comprend Desert Hedgehog (Dhh), Indian Hedgehog (Ihh) et Sonic Hedgehog, le plus étudié. Le morphogène Shh est largement exprimé dans le système nerveux central (SNC). La production de Shh est associée à une capacité de prolifération à la fois des cellules précurseurs des neurones endogènes pendant le développement embryonnaire et des cellules souches neurales dans la zone sous-ventriculaire adulte. Elle a un rôle diffus sur de nombreux organes au cours du développement. Cependant, les multiples effets de Shh sont très répandus mais encore incomplètement compris. Il a été mis en évidence que cette protéine exerce une influence sur le développement des neurones de la notochorde embryonnaire dans laquelle elle module l'induction des neurones moteurs et des cellules précurseurs d'oligodendrocytes (Capdevila and Johnson, 2000). Shh est également sécrétée par certaines cellules adultes telles que les neurones (He et al, 2013), les cellules épithéliales du tractus digestif (Yamanaka et al, 2011 ; Feng et al, 2012) ou les cellules dendritiques (Sacedon et al, 2005) et impliquée dans des processus de divisions cellulaires de l’hématopoïèse (Bhardwaj et al, 2001) et le développement de certains cancers en particulier gastro-intestinaux (Walter K. et al, 2010).

Shh est une glycoprotéine synthétisée sous forme d’un précurseur de 45kDa qui subit une auto-protéolyse produisant une protéine N-terminale de 19kDa (Shh-N) ayant toutes les

activités de signalisation et une protéine C-terminale de 25kDa possédant une activité protéasique à l’origine de l’autocatalyse (Figure 18).

Figure 18 : Structure 3D de la protéine ShhN.

Image tirée de [9] et (Pepinski et al, 2000)..

L’addition post-transcriptionnelle d’un résidu cholestérol sur la partie C-terminale du fragment N-terminal permet l’association de Shh-N à la membrane plasmique. Ce fragment Shh-N subit ensuite une seconde modification lipidique par l’addition, sur le résidu cystéine amino-terminal, d’un acide palmitique grâce à une protéine, la palmitoylacétyl transférase (Hart) donnant ainsi naissance à la forme mature et active de Shh : Shh-Np. Ces modifications post-transcriptionnelles ont lieu dans le réticulum endoplasmique (Bambakidis and Onwuzulike, 2012) ; (Figure 19).

L’adjonction d’un acide gras et d’un résidu cholestérol après ces modifications post-transcriptionnelles lui procure une propriété lipophile lui permettant d’être positionnée dans un radeau lipidique de la membrane plasmique Elle peut également être sécrétée sous forme de monomère pour une action autocrine, ou d’oligomères associés à la protéine DISP pour une action paracrine. Cette dernière forme masque les résidus cholestérol, augmentant ainsi l’hydrosolubilité de Shh et favorisant son processus de diffusion paracrine. (Eaton, 2008 ; Vyas et al, 2008) ; (Figure 19).

Figure 19 : Schéma récapitulatif de la synthèse, la sécrétion et la signalisation de la protéine Sonic Hedgehog.

La protéine Sonic Hedgehog (Shh) est synthétisée sous forme d’un précurseur de 45kDa qui subira une autocatalyse par sa partie C-terminale, aboutissant à une protéine de 19kDa. Lors de l’autolyse, un résidu cholestérol est ajouté en C-terminal de la partie N-terminale, puis un acide palmitique ajouté par la palmityilacétyl transférase (Hart) permettra d’obtenir une protéine fonctionnelle. Elle est secrétée par diffusion ou après agrégation par la protéine DISP au niveau des radeaux lipidiques de la membrane plasmique. Au niveau de la cellule cible, Shh agit via 2 récepteurs : Ptch et Smo qui permettent l’activation et la translocation d’un facteur de transcription : Gli.

III.C.2.b) Voie de signalisation Shh

La voie de signalisation Shh principalement décrite dans le cil primaire des cellules ciliées est complexe.

Elle implique deux récepteurs transmembranaires présents sur la cellule réceptrice du signal : Patched (Ptch), une protéine à douze domaines transmembranaires et Smoothened (Smo), une protéine à sept domaines transmembranaires présentant la typologie des récepteurs couplés aux protéines G. Shh se lie à Ptch tandis que Smo agit comme un transducteur du signal. Cette protéine Smo est ancrée dans la membrane des vésicules intracellulaires en l’absence d’activation par Shh (Burglin, 2008). En absence de signalisation, Ptch interagit avec Smo, l’inhibant et empêchant ainsi sa translocation au niveau de la membrane plasmique. Un complexe lié aux microtubules composé (chez les vertébrés) des protéines Kif7 (Kinesin Family member 7), Suppressor of Fused (SuFu) et de Gli recrute des kinases dont la protéine kinase A, maintenant ainsi le facteur Gli sous une forme réprimée et inhibant sa translocation dans le noyau. La liaison de Shh à Ptch lève l’inhibition de Ptch sur Smo qui se fixe à la membrane plasmique. La liaison du complexe lié aux microtubules via l’interaction de Kif7 avec la partie C-terminale de Smo va permettre la libération de Gli (Taipale et al, 2002 ; Chen and Jiang, 2013) ; (Figure 20).

Figure 20 : Mode d’action des récepteurs de Shh.

Les facteurs de transcription Gli au nombre de 3 (Gli 1-2-3) possèdent cinq domaines en doigt de zinc permettant leur liaison à l’ADN. Gli 1 et Gli 2 sont des activateurs transcriptionnels, tandis que Gli 3 est un répresseur (Koebernick and Pieler, 2002) ; (Figure 19-20).

Les gènes cibles de Shh ne sont actuellement pas encore tous connus mais certains ont été décrits comme étant impliqués dans :

• l’auto-activation des gènes Gli et Ptch (Katoh and Katoh, 2009)

• la régulation du cycle cellulaire comme les cyclines D1/2 et E (Katoh and Katoh, 2009)

• la survie cellulaire via l’activation de l’expression des facteurs anti-apoptotiques (Bcl2/CFLAR) (Kasper et al, 2006)

• la néoangiogenèse (VEGFα, ANG1) (Lee et al, 2007 ; Pola et al, 2001)

III.C.2.c) Intérêt de Shh pour la thérapie génique transitoire

Plusieurs arguments ont orienté le choix de Shh comme protéine d’intérêt pour son utilisation en thérapie génique transitoire dans le traitement du SCR.

Tout d’abord le caractère sécrété de la protéine Shh qui permet sa libération et sa diffusion par la cellule transfectée au niveau du site d’injection. De plus, Shh intervient dans de nombreux processus biologiques tel que l’embryogenèse, la différenciation des cellules souches hématopoïétiques, la régénération des cellules ostéblastiques (Hofmann et al, 2009 ; Dohle et al, 2010 ; Fan et al, 2013), et de manière plus spécifique au SCR, dans les processus de l’angiogenèse (Pola et al, 2001) et de la prolifération cellulaire (Parisi and Lin, 1998 ; Mimeault and Batra, 2010). Plusieurs travaux in vitro rapportent un effet pro-angiogénique indirect de Shh par induction de la sécrétion de VEGFα et d’ANG1 par les cellules endothéliales et mésenchymateuses. D’autres études in vivo révèlent la formation de néovaisseaux et le recrutement de cellules endothéliales (Pola et al, 2001 ; Spek et al, 2010 ; Podolska et al, 2013 ; Tang et al 2013 ; Yao et al, 2014). Des travaux menés sur la régénération tissulaire ont également démontré un effet de Shh sur la prolifération des cellules épithéliales (Parisi and Lin, 1998) et sur la réparation du

tissu cutané par activation de la NO synthase qui elle-même favorise l’angiogenèse (Luo et al, 2009). Par ailleurs, Shh a été décrite comme impliquée dans la croissance et la morphogenèse du follicule pileux et joue un rôle crucial dans l’organisation des cellules du derme favorisant ainsi la réparation cutanée (Oro and Higgins, 2003). Les propriétés pro-angiogéniques de Shh en thérapie génique sur des modèles murins ont également montré une accélération de la cicatrisation de lésions cardiaques et musculaires (Kusano et al, 2005 ; Piccioni et al, 2013) et permettent ainsi d’envisager son utilisation afin d’optimiser le traitement du SCR (Donahue, 2006).

Enfin, les fibroblastes du derme, possédant des récepteurs Ptch et Smo, peuvent être une cible de Shh pour favoriser le remodelage de la matrice extracellulaire et la prolifération de ces cellules (Lee et al, 2007 ; Varjosalo and Taipale, 2008) impliquées dans la réparation cutanée.

Les traitements actuels ou envisagés du CRS par thérapie cellulaire ont fait l’objet d’une revue publiée (Annexe 2):

Advances in stem cell therapy; Specific application in the treatment of cutaneous radiation syndrome.