BONNES PRATIQUES EN MATIÈRE DE RELOGEMENT

O processo de purificação de uma proteína requer primeiramente a separação desta dos componentes celulares. Os tecidos e células são rompidos em solução tampão, obedecendo a certos critérios que evitam a desnaturação da proteína de escolha, de modo que se forma uma mistura denominada extrato bruto (BRACHT; ISHII-IWAMOTO, 2002). Estas biomoléculas podem ser purificadas de acordo com diferentes métodos que se

18 afinidade com outras moléculas (NELSON; COX, 2004).

Não existe uma sequência exata dos métodos de purificação a serem usados em todas as proteínas. Devlin (1998) e Voet; Voet (2005) relatam que deve-se escolher uma sequência de técnicas de purificação que resulte em um elevado grau de purificação e alto rendimento. A obtenção de métodos sensíveis e específicos para distinguir e medir quantitativamente a proteína que se pretende isolar é também indispensável.

Como pode ser observado na Tabela 2, há um grande interesse no estudo das proteases alcalinas das vísceras de peixes, seja com o objetivo de conhecer a fisiologia digestiva do peixe ou para demonstrar o potencial biotecnológico destas moléculas. Para estudar estas proteases é necessário primeiramente separá-las dos outros componentes celulares ou possíveis contaminantes encontrados nas vísceras destes animais. Vários trabalhos têm sido publicados com diferentes técnicas para esta finalidade (BEZERRA et al., 2001b; GARCIA-CARREÑO et al. 2002; KOMKLAO et al., 2004; BEZERRA et al., 2005; CASTILLO-YÁNEZ et al. 2005; KISHIMURA et al., 2005, 2006, 2007; BOUGATEF et al., 2007; SOUZA et al., 2007). As técnicas mais comuns utilizadas (e que tem apresentado melhores resultados quando utilizadas combinadas) por estes autores para purificar proteases alcalinas de vísceras de peixes são: Centrifugação, Tratamento térmico, Fracionamento por “Salting-out”, Gel filtração, Cromatografia de afinidade.

19 Centrifugação

A primeira etapa em um típico protocolo de purificação de proteína é a centrifugação. O princípio deste método é que diferentes partículas em suspensão (células, organelas ou moléculas), tendo diferentes massas ou densidades, estabelecer-se-ão no fundo de diferentes índices (DEVLIN, 1998). A centrifugação diferencial separa proteínas solúveis de materiais insolúveis; a força centrífuga e a duração da centrifugação são ajustadas para assegurar que os materiais insolúveis sedimentem, formando precipitados, de forma que as proteínas solúveis permaneçam no líquido sobrenadante. As proteínas aí contidas podem ser então separadas por outros métodos de purificação (NELSON; COX, 2004).

Tratamento térmico

O tratamento térmico do extrato bruto têm sido uma ferrramenta inicial ou intermediária eficiente no processo de purificação de proteases alcalinas de peixes. Esta técnica foi primeiramente testada para enzimas de peixes por Bezerra et al. (2001b), com o propósito de diminuir a quantidade de proteases, eliminando aquelas termolábeis.

Fracionamento salino e com etanol: Purificações fundamentadas nas diferenças de solubilidade

Uma vez o extrato bruto aquecido pronto, vários métodos têm sido usado para purificar as enzimas de peixes. Um método comum que tem sido adotado por vários autores é submeter o extrato a tratamentos que separem a proteína em diferentes frações, baseados em propriedades como tamanho ou carga.

20 Devido a sua baixa constante dielétrica (quando comparado com a água), solventes orgânicos aumentam a atração entre as moléculas de proteínas, formando agregados, até que as partículas assumam proporções macroscópicas e precipitem. Este fenômeno consiste na remoção da água de solvatação da proteína, permitindo que forças eletrostáticas induzam regiões de cargas opostas da proteína a se atraírem. Neste caso, a água é removida tanto pelo solvente orgânico, como pela estruturação ao redor da molécula orgânica. Como consequência, a constante dielétrica é diminuída (SCOPES, 1988; WANG et al., 1979; HARRISON, 1993).

Os álcoois - metanol, etanol e isopropanol - são os mais importantes precipitantes industriais. O etanol, no entanto, apresenta o balanço ideal entre o efeito na solubilidade e características hidrofóbicas adequadas para reduzir a desnaturação. A precipitação com etanol é uma técnica promissora que pode ser aplicada para muitos tipos de proteínas em escala industrial. O etanol é, depois da água, o mais importante dos solventes, por possuir boas características físico-químicas, como uma completa miscibilidade com a água, baixo ponto de fusão, ausência de risco de misturas explosivas, alta volatilidade, inércia química, baixa toxicidade e baixo custo, especialmente no Brasil (CORTEZ; PESSOA Jr., 1999).

Os sais neutros têm efeito pronunciado sobre a solubilidade de proteínas. Para Nelson; Cox (2004) os sais de íons divalentes, tais como MgCl2 e (NH4)2SO4, são muito mais eficientes na solubilização do que os sais de íons monovalentes como o NaCl, NH4Cl e KCl. Com o uso dos sais ocorre o aumento de solubilidade (salting in) ou perda de solubilidade (salting out) das proteínas. O sulfato de amônio é o sal mais usado para a precipitação, pois tem solubilidade acentuada e produz força iônica elevada (BRACHT; ISHII-IWAMOTO, 2002).

21 Os métodos mais eficientes de fracionamento de proteases de peixes fazem uso de colunas de cromatografia, que podem estar baseada nas diferenças de carga das proteínas, no tamanho, na afinidade com o ligante e outras propriedades. Um material poroso sólido com propriedades químicas apropriadas (a fase estacionária) é colocado na coluna e uma solução tampão (fase móvel) percorre através dele. A solução contendo a proteína, colocada no da coluna percorre através da matriz sólida (NELSON; COX, 2004).

A cromatografia de exclusão molecular, também conhecida como cromatografia em gel ou ainda gel filtração, separa as proteínas em função do seu peso molecular. Neste método proteínas maiores atravessam a coluna mais rapidamente que as proteínas de tamanho menor. A fase sólida consiste de esferas com poros projetados ou cavidades de tamanhos particulares. As proteínas grandes não conseguem entrar nos poros, portanto tem uma curta (e rápida) passagem pela coluna em volta das esferas. As proteíns pequenas entram nas cavidades e, como resultado, migram através da coluna mais lentamente (NELSON; COX, 2004).

As colunas de gel filtração mais comumente utilizadas para purificar enzimas de peixes são: Sefadex G-50, G-75 e G-100 (KISHIMURA et al., 2007; BEZERRA et al., 2005; SOUZA et al., 2007; BOUGATEF et al., 2007).

Cromatografia de afinidade: Purificações fundamentadas na separação por adsorção seletiva

A cromatografia de afinidade baseia-se no principio de que as proteínas podem ser separadas de acordo com a sua capacidade de se ligar de forma não-covalente a outra molécula. Esse tipo de cromatografia apresenta ligantes que podem ser substratos enzimáticos ou outras moléculas, como anticorpos. A coluna de afinidade reage quando a

22 pela coluna. As proteínas ligadas à coluna são, então, decantadas pela adição de excesso do ligante ou pela mudança na concentração de sal ou pH (BRACHT; ISHII-IWAMOTO, 2002; DEVLIN, 1998).

Os parâmetros de solubilidade para separar proteínas são usados, sobretudo nas fases iniciais de purificação protéica, mas eles não fornecem a resolução elevada dos métodos cromatográficos e eletroforéticos, bem mais precisos em relação às impurezas remanescentes (DEVLIN, 1998).

Determinação da sequência de aminoácidos N- terminal

Frequentemente, após a purificação e o cálculo da massa molecular da proteína de interesse, a análise realizada é o sequenciamento dos seus aminoácidos. A partir da determinação da estrutura primária da proteína, várias informações podem ser obtidas sobre a sua função e a história evolutiva.

Pehr Edman estabeleceu um método de marcação e clivagem do aminoácido amino-terminal sem romper as ligações peptídicas entre os outros aminoácidos. Esta técnica, denominada degradação de Edman, remove sequencialmente um aminoácido de cada vez da extremidade amino-terminal do peptídeo. Para tanto, o fenilisotiocinato (reagente de Edman) reage primeiramente com o grupo amino-terminal do peptídeo. Posteriormente, esse peptídeo é submetido a tratamento com ácido diluído em baixas temperaturas para que ocorra a remoção do resíduo n-terminal como um derivado fenilhidantoínico, o qual pode ser identificado por cromatografia. O restante da cadeia é submetido à outra série destas reações, permitindo a identificação de novos resíduos n- terminal, determinando assim a sequência do peptídeo (VOET e VOET, 2005; NELSON e COX, 2004).

23 conhecimento do mecanismo molecular de ação do peptídeo, para a comparação de sequências entre proteínas análogas de um mesmo indivíduo, de membros da mesma espécie e de espécies relacionadas.

Com base nestas informações muitas enzimas digestivas, principalmente as serino proteases como a tripsina de peixes marinhos, já foram submetidas aos métodos de identificação e tiveram seus resíduos de aminoácidos n-terminal sequenciados: salmão do Atlântico (Salmo salar) (MALE et al., 1995); anchovas (Engraulis japonicus) (AHSAN; WATANABE, 2001); Pomatomus saltatrix (KLOMKLAO et al., 2007b); sardinha (Sardina pilchardus) (BOUGATEF et al., 2007); Sebastes schlegelii e Alcichthys alcicorns (KISHIMURA et al., 2007).