Préparation de synaptosomes à partir de cerveaux de rat
Le protocole est largement inspiré du protocole de référence de préparation des synaptosomes sur gradient de sucrose (Carlin et al., 1980). Les synaptosomes sont préparés à partir de cerveaux de rats adultes de lignée OFA. Nous avons utilisé des animaux des deux sexes âgés de 2 à 4 mois. Les animaux sont sacrifiés par décapitation après anesthésie par inhalation d’Isoflurane. Le cerveau est rapidement isolé et placé dans du tampon d’homogénéisation (sucrose 0,32 M ; HEPES 4 mM, pH 7,4 ; NaF 15 mM ; β-glycérophosphate 15 mM ; cocktail d’inhibiteur de protéases (Roche)). Après rinçage, le cerveau est grossièrement haché et broyé dans du tampon d’homogénéisation (1 mL / 100 mg de tissu) à l’aide d’un potter (15 aller-retours, 500 rpm). L’homogénat est centrifugé 10 min à 1 400 x g. Le surnageant est conservé et le culot repris dans 8 mL de tampon d’homogénéisation puis centrifugé à 10 min à 800 x g. Les deux surnageants sont poolés (S1) et centrifugés à 10 min à 13 800 x g pour obtenir un culot de membranes totales (P2) et du cytosol (S2). Le P2 est repris dans 4 mL de tampon d’homogénéisation et 4 x 1 mL sont déposés sur 4 gradients discontinus de sucrose (0,85 M ; 1 M ; 1,2M : 3,5 mL de chaque). Le gradient est centrifugé 2 h à 82 500 x g (27 000 rpm, rotor Beckmann SW 41). Les synaptosomes (SYN) sont récupérés à l’interface 1-1,2 M, dilués dans du tampon d’homogénéisation et centrifugés à nouveau à 100 000 x g. Les synaptosomes sont utilisés dans la foulée ou repris dans du tampon d’homogénéisation et stockés à -80°C.
Purification de densité post-synaptique
Le culot de synaptosomes (500 µg) est repris dans, pH 7,4 contenant 0,5% de TritonX-100 et incubé sur roue 30 min à 4°C. Après centrifugation 20 min à 32 000 x g, le culot (PSDI) est divisé en deux. La première moitié est solubilisée dans les mêmes conditions et centrifugé 20 min à 200 000 x g (culot PSDII). La deuxième moitié est solubilisée dans 1 mL de tampon HEPES 50 mM pH 7,4 contenant 3% de sarkosyl et centrifugée 1 h à 200 000 x g. Les culots sont repris dans 0,1% de SDS, dosés avec un réactif BCA (Pierce), puis déposés sur gel SDS-PAGE en équivalence de masse.
Test de solubilisation du CHMP2B synaptique par différents détergents
Des culots de synaptosomes (200 µg) sont repris dans 500 µ L de de tampon HEPES 50 mM pH 7,4 (ou 9,0 pour le DOC) contenant 1% de digitonine, de TritonX-100, de n-Dodecyl-beta-D-Maltoside, de DOC ou de SDS. Les échantillons sont incubés sur roue, 30 min à 4°C, et centrifugés 20 min à 20 000 x g. Les culots sont déposés en équivalence de volume sur gel SDS-PAGE.
Couplage covalent des IgG sur des billes de protéine A magnétiques
50 µ L de Dynabeads Protéine A (Invitrogen) sont lavées deux fois dans du PBS contenant 0,1% de TritonX-100 puis incubées pendant 1 h minimum, sur une roue et à température ambiante (TA), avec 15 µg d’anticorps dilués dans 1mL du même tampon. Les billes sont lavées deux fois dans du tampon borate 0,2 M, pH 9,0. Le couplage covalent est effectué par une incubation de 30 min à TA dans 20 mM de diméthyl-pimélimidate (DMP) dilué dans du tampon Borate. Les billes sont ensuite incubées dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 pendant 15 min. Les IgG non couplées sont éliminées par un rapide lavage un tampon Glycine 100 mM, pH 2,5. Les billes sont lavées en PBS et stockées dans 100 µ L de PBS contenant 0,02% d’azide de sodium.
Immunoprécipitation de CHMP2B synaptique
Les synaptosomes purifiés (500 µg) sont solubilisés dans 1 mL de tampon Tris 20 mM pH 9,0 ; 150 mM NaCl ; 15 mM NaF ; 1% sodium deoxycholate (DOC) et inhibiteurs de protéases, pendant 30 min sur roue à 4°C. Après 20 min de centrifugation à 100 000 x g, le surnageant est dilué dans trois volumes de tampon Tris 50 mM pH 7,4 ; 150 mM NaCl ; 15 mM NaF et 1% TritonX-100 et inhibiteurs de protéases. Le mélange est préadsorbé 30 min sur des billes de protéine A magnétiques couplées avec des IgG de lapin non spécifiques. Le surnageant correspond à l’input et est soumis à l’IP pendant 2 h à 4°C. Les billes sont ensuite lavées 5 fois dans un tampon identique, mais contenant 0,75% TritonX-100 et 0,25% DOC. Un sixième lavage est effectué dans un tampon contenant 0,1% de Triton. Les protéines sont éluées dans 200 µ L de tampon Laemmli 1,5X et mises à bouillir pendant 10 min. Les billes sont éliminées et 40 µ L sont déposés sur gel SDS-PAGE en vue d’une coloration au nitrate d’argent (20 µ L pour une analyse en Western-Blot).
Pull-down à partir de CHMP2B-His recombinant
La protéine recombinante (50 µ g) préalablement purifiée en conditions dénaturantes, est dilué 10 fois, goutte à goutte, dans un tampon 50 mM phosphate de sodium, pH 7,4 ; 300 mM NaCl ; 0,1% TritonX-100 et laissée à renaturer sur roue, à température ambiante, pendant 10 min. La protéine est immobilisée à nouveau sur des billes Talon Metal Affinity (Clontech). Les billes sont lavées rapidement et équilibrées avec un tampon Tris 50 mM pH 7,4 ; 150 mM NaCl ; 15 mM NaF et 0,75% TritonX-100 et 0,25% DOC. Les synaptosomes sont préparés de la même manière que pour les IP, à l’exception que le pH du tampon de solubilisation est fixé à 11,0 au lieu de 9,0. La fraction soluble est diluée, ramenée à pH physiologique et incubée pendant 2 h sur les billes. L’élution est identique à l’IP.
Immunoprécipitation à partir de lysats de cellules HEK
Les cellules HEK sont lysées mécaniquement dans un tampon d’homogénéisation (sucrose 0,32 M ; HEPES 4 mM, pH 7,4 ; NaF 15 mM ; β-glycérophosphate 15 mM ; cocktail d’inhibiteur de protéases (Roche)), à l’aide d’un potter. Après 10 min de centrifugation à 800 x g, le surnageant est centrifugé à 10 min à 15 000 x g, pour isoler un culot de membranes totales. Les membranes sont solubilisées dans un tampon Tris 20 mM pH 9,0 ; 150 mM NaCl ; 15 mM NaF ; 1% sodium deoxycholate (DOC) et inhibiteurs de protéases, pendant 30 min sur roue à 4°C. Après 20 min de centrifugation à 20 000 x g, le surnageant est dilué dans trois volumes de tampon Tris 50 mM pH 7,4 ; 150 mM NaCl ; 15 mM NaF et 1% TritonX-100 et inhibiteurs de protéases.
Analyse protéomique en spectrométrie de masse
Ces analyses sont effectuées au CEA de Grenoble (Y. Couté, plateforme EDyP). Lors des expériences destinées à la spectrométrie de masse, un maximum de précautions sont prises pour éviter la contamination des échantillons par des protéines bactériennes ou des kératines humaines. Le protocole d’analyse détaillé se trouve dans la partie Materials and Methods de l’article 2.
Chromatographie d’exclusion de taille
La colonne Sephacryl S-300 HR est pré-équilibrée avec 3 volumes de tampon de colonne Tris 20 mM pH 7,4 ; 150 mM NaCl ; 15 mM NaF ; 15 mM béta-glycérophosphate ; 0,5% TritonX-100 et inhibiteurs de protéases. Les synaptosomes fraichement purifiés (10 mg) sont solubilisés dans 3 mL de tampon Tris 20 mM pH 9,0 ; 150 mM NaCl ; 15 mM NaF ; 1% sodium deoxycholate (DOC) et inhibiteurs de protéases, pendant 30 min sur roue à 4°C. Après 20 min de centrifugation à 100 000 x g le surnageant est filtré à 0,2 µm. 2,5 mL d’échantillon sont injectés et la séparation est poursuivie avec du tampon de colonne (120 mL, 0,5 mL/min). 60 fractions de 2 mL sont récupérées. Lors des analyses en Western-Blot, 25 µ L des fractions 15 à 47 sont déposées (elles recouvrent l’intégralité du volume utile de la colonne). Pour les séparations en vue des immunoprécipitations, les fractions 18 à 21 (complexe contenant CHMP2B) d’une part, et 33 à 37 (monomère) d’autre part, sont poolées et soumises à l’IP.
SDS-PAGE et Western-Blot
Les protéines sont reprise dans du tampon Laemmli (60 mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycérol, 5% β-mercaptoéthanol, 0.01% bleu de bromophénol) et déposées sur un gel d’acrylamide de concentration adaptée. Le gel est mis à migrer pendant environ 90 min à 25
mA par gel (surface 10 x 8 cm). Il est ensuite transféré sur une membrane de PVDF par électrotransfert semi-sec (de 45 min à 1h15 par surface de gel en fonction de la taille des protéines à transférer : 20 V, 400 mA). La membrane est lavées à l’eau distillée, puis incubée 1h dans du tampon TBS-TL (Tris 20 mM, 150 mM NaCl, pH 7,5, 0,1 % de Tween20 et 5 % de lait), sous agitation. L’anticorps primaire est incubé 1 h à température dans du TBS-TL ou alternativement la nuit à 4°C. La membrane est lavée 6 fois sur 30 min dans du TBS-T puis incubée 30 min avec l’anticorps secondaire, couplé à la HRP (Horseradish peroxydase), dilué dans du TBS-T. La membrane est lavée à nouveau 5 fois dans du TBS-T et une dernière fois dans du TBS sans détergent. Elle est incubée dans un réactif ECL maison ou commercial (Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate, Millipore), pour plus de sensibilité. Les bandes sont révélées en chambre noire sur des films photographiques (BioMax MR Film Carestream).