Le benzo[a]pyrène

3.2.1. Caractéristiques générales

Le benzo[a]pyrène (BaP) est une molécule constituée de la répétition de 5 cycles

aromatiques et de formule brute C20H12. A température ambiante, il se présente sous la forme

Figure 7 : Devenir du benzo[a]pyrène absorbé par voie orale dans l'organisme. (Modifiée d’après Ramesh

et al. 2004)

Le benzo[a]pyrène (BaP, rond noir) ingéré ou inhalé rejoint le tractus digestif à partir duquel il est transporté dans le foie pour être métabolisé. Les différents métabolites, hydroxylés (BPO, rond vert) ou conjugués (BPC, un rond vert) produits au niveau hépatique et intestinal (par les entérocytes) rejoignent la circulation sanguine systémique ou sont excrétés dans l’urine et les fèces.

33 donc peu soluble dans l’eau mais soluble dans les solvants organiques. Les propriétés physico- chimiques du BaP sont regroupées dans le Tableau 5.

3.2.2. Toxicité

Le BaP est considéré comme le plus toxique des HAP. En effet, en termes de cancérogénicité, le BaP est répertorié au niveau mondial par l’IARC (International Agency for Research on Cancer) comme cancérigène de classe 1 (cancérigène avéré pour l’Homme) (Baan et al., 2009). Il est également classé comme ayant de fortes présomptions d’effets cancérogène, mutagène et toxique pour la reproduction (CMR) par l’Union Européenne (CMR de catégorie 2) selon la directive 67/548/CEE modifiée.

Des études de toxicité aiguë ont été menées in vivo chez l’animal. Elles ont permis de déterminer des doses ou concentrations létales 50 (DL50 ou CL50), qui correspondent respectivement à la dose et à la concentration entrainant, après une administration unique, 50% de mortalité dans la population d'organismes étudiée. Ainsi, il a été déterminé une DL50 de 250 mg/kg de poids corporel administrée par voie intrapéritonéale chez la souris et une DL50 de 50 mg/kg de poids corporel administrée par voie sous-cutanée chez le rat (INRS, 2007). Les effets mutagéniques, carcinogéniques, cytotoxiques, teratogéniques et pro-inflammatoires du BaP ont été démontrés dans de nombreux modèles animaux (Miller & Ramos, 2001; Baird et al., 2005; Bekki et al., 2013; Zuo et al., 2014). Qamar et al. (2012) ont par exemple montré que chez le rat une exposition intratrachéale à 5 mg de BaP/kg de poids corporel induisait une inflammation, un œdème et des dommages à l’épithélium au niveau pulmonaire. Le BaP possède également des effets toxiques sur la fertilité. Une atrophie testiculaire accompagnée d’une réduction du nombre et de la viabilité des spermatozoïdes ont en effet été observées chez la souris après une administration chronique de BaP par voie orale pendant 30 jours (Jeng & Bocca, 2013).

3.2.3. Les sources et voies d’exposition pour l’Homme

L’Homme est exposé aux BaP selon 3 voies différentes : l’inhalation d’air contaminé, le contact direct avec un environnement pollué (retombées de poussières atmosphériques, eau ou sol), et l’ingestion d’aliments ou d’eaux contaminés. Dans le cas particulier du tractus digestif, la contamination survient par voie orale, ce qui comprend à la fois l’ingestion et l’inhalation du BaP (Figure 7) (Diggs et al., 2011).

Tableau 5 : Caractéristiques physico-chimique du benzo[a]pyrène (BaP). (Adapté de la fiche de sécurité

de Sigma-Aldrich)

Dénomination benzo[a]pyrène ; 3,4-benzpyrène ; 3,4-benzopyrène ; benzo[def]pyrène

Numéro CAS (Chemical Abstracts Service) 50-32-8

Formule brute C20H12

Formule semi-développée

Masse molaire 252,31 g.mol-1 Température de fusion 179°C

Température d’ébullition (à 1,3 kPa) 479°C

Solubilité dans l’eau (à 25°C) 0,0038 mg.L-1 Coefficient de partage octanol/eau (LogP ou Log Kow) 5,97

Densité relative 1,35 g.m-3

Aspect physique (à 25°C) Cristaux solides jaunes et inodores

Figure 8 : Les principales voies de contamination des aliments par le BaP. (Modifiée d’après Bansal and

Kim 2015)

Différents aliments peuvent être contaminés par le BaP tels que les légumes, les fruits, les graines, les huiles végétales, les viandes, les poissons ou encore les fruits de mer. La contamination de ces aliments a lieu par voie environnementale (dépôt des BaP présents dans la pollution atmosphérique sur les cultures, les sols et les milieux aquatiques) et/ou synthétique (méthode de cuisson et procédés industriels).

Figure 9 : Formation du BaP au cours de la pyrolyse des aliments. (Modifiée d’après (Trafialek &

Kolanowski, 2014)

34 Ingestion d’aliments contaminés

L’ingestion d’aliments contaminés est la voie majoritaire de l’exposition du système digestif au BaP (Phillips, 1999). Deux types de contamination alimentaire sont distingués : celle liée à l’environnement, due au dépôt de la pollution atmosphérique, et celle liée à la transformation des aliments, en particulier lors de leur cuisson (Figure 8).

Parmi les aliments consommés crus, le BaP, mais de manière plus générale les HAP, sont retrouvés dans les légumes, les fruits, les graines et les produits de la pêche. En ce qui concerne la présence du BaP dans et/ou sur les végétaux, trois sources possibles ont été identifiées, à savoir la biosynthèse endogène, l’incorporation à partir du sol contaminé, et l’absorption via la pollution atmosphérique. Cette dernière est considérée comme la route majoritaire de la contamination des végétaux, les deux autres étant estimées minoritaires voire négligeables (Phillips, 1999). La teneur en BaP des fruits, des légumes et des graines dépend donc fortement de l’environnement dans lesquels ils sont cultivés. Ainsi les végétaux pour lesquels les quantités les plus importantes de BaP sont observées, sont récoltés près de zones de trafic routier dense (Ramesh et al., 2004). La pollution atmosphérique se dépose également dans les environnements lacustres et océaniques où le BaP est absorbé par les organismes aquatiques, s’accumulant alors dans la chaine alimentaire (fruits de mer, poissons…) (Phillips, 1999).

La contamination des aliments, notamment des viandes et des poissons, a cependant principalement lieu durant leur transformation, aboutissant ainsi à la néoformation de BaP, en particulier lorsque les aliments sont grillés, cuits au barbecue, rôtis, frits, ou fumés (Bansal & Kim, 2015). Le BaP formé au cours de la cuisson est issu de la pyrolyse des protéines, des lipides et des glucides contenus dans les aliments (Figure 9). En général, lorsque la cuisson est réalisée dans des conditions contrôlées et maitrisées, peu de BaP est produit, ce dernier étant principalement retrouvé lorsque les aliments sont carbonisés (Phillips, 1999). Les modes de cuisson traditionnels, en opposition au processus industriels, produisent ainsi de très fortes quantités de BaP. Ce phénomène est d’autant plus important lorsque les aliments sont en contact direct avec une flamme. Par ailleurs, la source de chaleur employée pour cuire ou fumer l’aliment (combustion de bois ou de charbon de bois) peut également générer du BaP qui va ensuite être transporté par les fumées et déposé sur les aliments. De la même manière, les graisses issues des aliments tombant sur les flammes vont permettre la formation de ce polluant qui sera ensuite charrié par les fumées (Purcaro et al., 2013). La quantité de BaP produite dépendra donc du type de cuisson réalisée (barbecue, fumage, rôtissage…), de la distance entre

Tableau 6 : Concentration en BaP dans les aliments consommés en France. (Adapté d’après Veyrand et

al. 2013)

Catégorie d’aliments _{d’échantillon analysé} Nombre _{(µg/kg de matières fraîches)} Concentration % > à la limite de détection

Mollusques et crustacés 37 0,234 76

Huiles 6 0,241 100

Margarine 4 0,151 100

Condiments et sauces 3 0,088 67

Charcuterie 80 0,045 88

Pizzas, quiches et pâtisseries salées 4 0,021 50

Biscuits sucrés et salés 8 0,024 56

Pains et biscottes 7 0,044 67 Viennoiseries 3 0,034 50 Pâtisseries et gâteaux 8 0,024 61 Poissons 46 0,025 61 Sandwichs 18 0,019 41 Plats cuisinés 61 0,010 33

Produits à base de pommes de terre 8 0,034 83

Œufs et produits à base d’œufs 30 0,009 27

Céréales du petit-déjeuner 3 0,011 34 Beurre 6 0,012 50 Viandes 64 0,012 30 Volailles et gibiers 38 0,068 100 Abats 16 0,011 5 Crèmes dessert 22 0,014 13 Fromages 32 0,015 34 Légumes 68 0,005 28 Boissons chaudes 9 0,003 56 Café 29 0,002 62

Produits laitiers frais 75 0,002 47

Lait 38 0,002 32

35 l’aliment et la flamme, de la température mais également de la durée de la cuisson (Phillips, 1999). La production de BaP peut être ainsi réduite en cuisant les aliments à des températures plus basses sur des périodes de temps plus longues. La contamination d’un aliment va également être influencée par sa composition. En effet, de par sa nature lipophile, le BaP a tendance à s’accumuler dans les graisses. Sa quantité retrouvée dans l’aliment est ainsi d’autant plus importante que ce dernier est riche en matières grasses (Saito et al., 2014). Ainsi, des concentrations très importantes de l’ordre de 700 µg de BaP/kg ont été retrouvées dans des saucisses fumées (Dobríková & Světlíková, 2007). Jusqu’à 52 µg de BaP/kg ont pu également être détectés dans des sardines fumées (Essumang et al., 2012). La concentration moyenne en BaP dans les aliments consommés en France est indiquée dans le Tableau 6.

A partir de la teneur en BaP des aliments et en connaissant la quantité d’aliments consommées, il est donc possible d’évaluer la dose quotidienne ingérée par un individu. Il est ainsi estimé qu’un individu ingère en moyenne 472 ng de BaP/jour en Asie, entre 20 et 80 ng de BaP/jour en Amérique du Nord et entre 14 et 270 ng de BaP/jour en Europe (Tableau 7) (AFSSA, 2004; Ma & Harrad, 2015). Cependant, même si de nombreuses études ont été conduites pour déterminer le taux de contamination des aliments, il reste difficile d’évaluer la quantité de BaP à laquelle un individu est exposé via son alimentation. En effet, chaque pays possède des traditions alimentaires culturelles qui lui sont propres et qui peuvent influencer très fortement la quantité de BaP présents dans l’alimentation, comme en Allemagne où environ 60% des produits carnés sont consommés fumés (Hitzel et al., 2013). Les choix alimentaires vont également moduler l’exposition d’un individu au BaP (consommation plus ou moins importante de produits cuits au barbecue, régime végétarien…). L’évaluation de la contamination alimentaire diffère, par ailleurs, entre les études. En effet, certaines études ne prennent en compte que les aliments crus (Veyrand et al., 2013), alors que d’autres estiment en plus l’apport des HAP néoformés durant la cuisson des aliments (Abramsson-Zetterberg et al., 2014).

L’ingestion de sols pollués via un contact main-bouche, phénomène particulièrement important chez les enfants, participe également à la contamination par voie orale des individus au BaP (Ruby & Lowney, 2012).

Inhalation de l’air pollué

Le tractus digestif n’est pas uniquement exposé au BaP par l’ingestion d’aliments ou de sols contaminés. L’air pollué (gaz d’échappement, chauffage domestique, fumée de

Tableau 7 : Estimation de l'exposition au BaP suite à l'ingestion d'aliments contaminés en fonction des différentes zones géographiques (Adapté d’après AFSSA 2004 et Ma and Harrad 2015)

Zone géographique Dose de BaP ingéré/jour pour un individu adulte Amérique du Nord 20-80 ng Asie 472 ng Europe – Allemagne 67 ng Europe – Belgique 14 ng Europe – Danemark 16 ng Europe – Espagne 36 ng Europe – Finlande 270 ng Europe – France 90 ng Europe – Grèce 100 ng Europe – Italie 170 ng Europe – Norvège 17-26 ng Europe – Pays-Bas 87,5 ng Europe – Royaume-Uni 36 ng

36 cigarette…) est également une source de contamination pour le système digestif. Ce dernier peut, en effet, se retrouver en contact avec le BaP venant de l’arbre pulmonaire par le phénomène de clairance mucociliaire, également appelé escalier mucociliaire (Semmler- Behnke et al., 2007). Les voies aériennes, de la trachée jusqu’aux bronchioles respiratoires, sont recouvertes de cellules ciliées et de cellules à mucus (cellules caliciformes). Le mucus forme un tapis glaireux retenant les particules et les débris. Ainsi, après avoir été inhalées, les matières particulaires, sur lesquelles le BaP est adsorbé, sont captées par le mucus. Ce dernier est alors propulsé par les battements synchrones des cils vibratiles vers le pharynx pour être dégluti et donc par la suite atteindre le système digestif.

Les doses de BaP auxquelles un individu est exposé via l’inhalation varient en fonction de sa zone d’habitation (urbaine ou rurale) et de son mode de vie (fumeur, mode de chauffage

domestique…). L’air extérieur est en effet, plus pollué en milieu urbain (1 à 10 ng de BaP/m3₎

notamment car le trafic routier y est plus dense et donc les émissions de gaz d’échappement y

sont plus élevées qu’en milieu rural (0,2 ng de BaP/m3_{) (source EFSA). Les fumeurs actifs et}

passifs sont également plus exposés au BaP que les non-fumeurs ou les personnes peu exposées à la fumée de cigarette, car chaque cigarette contient environ 10 ng de BaP (Swauger et al., 2002). Des variations du niveau de pollution de l’air intérieur sont aussi observées en fonction du mode de chauffage utilisé (bois, fioul, gaz…) et de la saison (saison hivernale ou estivale) (Jung et al., 2011; Ma & Harrad, 2015).

Exposition professionnelle

L’exposition professionnelle au BaP concerne les salariés des industries utilisant des dérivés pétroliers ou des dérivés de la houille comme le goudron et le brai de houille. Ces industries sont : les cokeries (produisant du coke à partir de la distillation de la houille), les sidérurgies, les usines produisant de l’aluminium, du silicium et des électrodes en carbone, les aciéries, ou encore les fonderies. D’autres professionnels, comme les ramoneurs et les ouvriers manipulant du bitume (cantonniers et couvreurs), sont également fortement exposé au BaP de par leur activité professionnelle (Jacob & Seidel, 2002). Une augmentation de l’incidence des cancers du poumon, du scrotum, de la vessie, des reins et du côlon est observée chez ces ouvriers manipulant le goudron de houille. Cette augmentation peut être reliée à l’exposition au BaP car le goudron de houille contient 1 à 2% de ce polluant (Jacob & Seidel, 2002).

37 3.2.4. Cadre législatif et réglementations

Au niveau international, deux textes majeurs régissent les POP : la convention de Stockholm et le protocole d’Aarhus. Les HAP ne sont pas cités sur la liste déclaratoire de la convention de Stockholm, en revanche quatre HAP, dont le BaP, sont répertoriés dans le protocole d’Aarhus. Ce dernier est adopté en 1998 et fait suite à la convention de Genève de 1979 sur la pollution atmosphérique transfrontalière à longue distance. Signé par 39 états sous l’égide de la Commission Economique des Nations Unies pour l’Europe (CEE-NU), et entré en vigueur en 2003, il vise à contrôler, réduire ou éliminer 16 polluants, dont le BaP, de l’environnement en Europe, en Amérique du Nord et en Asie centrale. En France, le décret n°2010-1250 du 21 octobre 2010 transpose la directive 2008/50/CE du Parlement européen et du Conseil du 21 mai 2008 concernant la qualité de l'air ambiant et un air pur pour l'Europe. Il fixe pour chaque substance de la pollution atmosphérique, dont le BaP, les seuils d'alerte, les seuils de recommandation et d’information et les valeurs limites pour la surveillance de la qualité de l’air ainsi que les valeurs cibles (valeurs à atteindre dans la mesure du possible et dans un délai donné pour prévenir ou de réduire les effets nocifs sur la santé humaine ou sur l'environnement).

En ce qui concerne les denrées alimentaires, la mise en place d’une législation harmonisée au niveau européen n’est devenue une priorité qu’après 2001 suite à la détection d’une huile d’olive hautement contaminée en République Tchèque. En 2002, le Comité Scientifique de l’Alimentation émet un avis considérant que le BaP seul peut être utilisé comme marqueur de la contamination des aliments par les HAP. Suivant cet avis, la Commission Européenne a instauré en 2005 et a mis à jour en 2006 une réglementation qui vise à harmoniser la législation des états membres de l’UE et qui fixe des valeurs seuils de concentration en BaP dans différentes classes d’aliments (Purcaro et al., 2013). En août 2011, une nouvelle règlementation (835/2011) est édictée par l’UE. Cette nouvelle réglementation prend en compte l'avis de l’autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA, European Food Safety Authority) et fixe de nouvelles valeurs seuils pour la concentration en BaP et pour la somme des concentrations de 4 HAP (BaP, chrysène, benz[a]anthracène et benzo[b]fluoranthène) dans les aliments (Purcaro et al., 2013; Bansal & Kim, 2015).

En France, la Direction Générale de la prévention des risques du Ministère de l’Ecologie du Développement Durable et de l’Energie a confié à l’INERIS (Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques) la mission de recenser les valeurs réglementaires

Tableau 8 : Valeurs limites de concentration en BaP applicables en France depuis décembre 2013.

(Adapté du rapport de l’INERIS 2014)

Catégorie Limite ou seuil de qualité

Eaux de surface (rivières, lacs…) Moyenne annuelle = 1,7.10-4 µg/L _{Concentration maximale admissible = 0,27 µg/L}

Air ambiant extérieur 0,001 µg/m3

Eaux destinées à la consommation humaine 0,01 µg/L

Huiles et graisses (à l’exclusion du beurre de cacao) destinées à la consommation humaine directe ou à

une utilisation comme ingrédient des denrées alimentaires 2 µg/kg

Fèves de cacao et produits dérivés 5 μg/kg de graisses

Huile de coco destinée à la consommation humaine directe ou à une utilisation comme ingrédient de

denrées alimentaires 2 µg/kg

Viandes fumées et produits de viande fumés 2 µg/kg

Chair musculaire de poissons fumés et produits de la pêche fumés 2 µg/kg Sprat et sprat en conserve (sprattus) fumés 5 µg/kg Mollusques bivalves frais, réfrigérés ou congelés 5 µg/kg Viandes traitées thermiquement et produits à base de viande traités thermiquement vendus au

consommateur final 5 µg/kg

Mollusques bivalves fumés 6 µg/kg

Préparations à base de céréales et aliments pour bébés destinés aux nourrissons et enfants à bas âge 1 µg/kg

Préparations pour nourrissons et préparations de suite, y compris le lait pour nourrissons et le lait de suite 1 µg/kg

38 qui doivent être appliquées. Une première synthèse de ces valeurs réglementaires applicables en France a été publiée en juin 2006. Cette synthèse est régulièrement mise à jour et les valeurs en vigueur depuis décembre 2013 sont présentées dans le Tableau 8.

3.2.5. Le métabolisme du BaP chez les mammifères

Les HAP sont des molécules hydrophobes chimiquement inertes et qui acquièrent leurs propriétés toxiques via une activation métabolique. Chez les mammifères, la métabolisation du BaP et plus généralement des HAP, se déroule en trois étapes faisant intervenir (i) des enzymes dites de phase I, conduisant à l’activation du BaP en des composés nucléophiles, (ii) des enzymes de phase II, responsables de la conjugaison des métabolites issus de la phase I, et (iii) des transporteurs permettant l’excrétion des produits issus des réactions enzymatiques des phases I et II (Bock, 2014). Le métabolisme du BaP a lieu principalement dans le foie vers lequel il est transporté. Cependant, les enzymes permettant la métabolisation du BaP sont également présentes, en plus faible quantité, dans les tissus extra-hépatiques comme le tractus intestinal (Diggs et al., 2011).

Il existe trois voies principales d’activation du BaP : (i) la voie des diol-époxydes qui implique une activation du BaP par les enzymes à activité cytochrome P450 (CYP450) en intermédiaires diols époxydes ; (ii) la voie des o-quinones, dans laquelle les dihydrodiols formés dans la voie des diol-époxydes sont métabolisés en o-quinones ; et (iii) la voie du radical cation ou du carbocation, dans laquelle le C6 du BaP (le plus électrophile) subit une oxydation à un électron et entraîne la formation du radical cation (Ramesh et al., 2004). La voie des diol- époxydes est largement reconnue comme étant la voie majoritaire de métabolisation du BaP chez les mammifères (Xue & Warshawsky, 2005). La première étape de cette voie implique les CYP450. Les enzymes de cette superfamille possèdent un résidu cystéine conservé permettant la liaison avec un groupement hème. Ce dernier confère à ces enzymes leurs propriétés d’absorbance à 450 nm et donc leur qualification de cytochrome P450 (Alexandrov et al., 2010). Ces enzymes ne peuvent pas être dénommées en fonction de leur spécificité de substrat car elles sont capables de métaboliser une grande variété de composés et une même molécule peut être métabolisée par plusieurs CYP450. Elles sont donc regroupées en famille selon leur similarité de séquence en acides aminés (Alexandrov et al., 2010). Le BaP est principalement métabolisé par les CYP1A1 et CYP1A2 mais aussi par la CYP1B et certaines isoformes des classes de CYP2 et 3 (Benford et al., 2010). Les CYP450 sont des monooxygénases ajoutant un groupement hydroxyle au BaP et formant des arène-oxydes (ou dihydro-époxydes) très

Figure 10 : Activation métabolique du BaP. (Modifiée d’après Alexandrov, Rojas and Satarug 2010)

Représentation schématique des réactions chimiques séquentielles conduisant à partir du BaP à la formation d’adduits à l’ADN.

39 instables. Ces derniers peuvent être réarrangés en phénols (1-OH, 3-OH, 7-OH ou 9-OH-BaP) ou rapidement hydrolysés par une époxyde hydrolase en dihydrodiols (e.g. BaP-4,5- dihydrodiol, BaP-7,8-dihydrodiol ou BaP-9,10-dihydrodiol) (Gelboin, 1980). Ces dihydrodiols peuvent ensuite être métabolisés par une CYP450 pour former des diols époxydes (Baird et al., 2005). Ces derniers, en particulier le BaP-7,8-diol-9,10-époxyde (BPDE), sont des métabolites électrophiles qui peuvent interagir avec l’ADN, majoritairement en position N2 de la guanine, pour former des adduits (Figure 10). Une réparation incorrecte de ces adduits peut conduire à l’apparition de mutations (délétion, substitution, ou décalage du cadre de lecture) et entrainer un processus de cancérogénèse (Benford et al., 2010).

Les métabolites produits lors de la phase I (quinones, dihydrodiols, dihydrodiol époxydes…) sont ensuite pris en charge par les enzymes dites de phase II telles que les glutathion S-transférases, les UDP-glucuronosyltransférases ou encore les sulfotransférases (Shimada, 2006). Ces enzymes réalisent des réactions de conjugaison permettant l’obtention de molécules hydrophiles pouvant alors être excrétées dans la bille, les urines ou les fèces. La