Bactériologie du lait

Le diagnostic des infections mammaires à l’aide de la bactériologie est considéré comme étant la meilleure mesure de détection des mammites, s’il est réalisé régulièrement et sur toutes les mamelles (65). Il permet d’identifier les mammites cliniques, les mammites subcliniques mais aussi de connaître l’agent pathogène impliqué, grâce à quoi, le vétérinaire peut mettre en place le traitement et les mesures de gestion les plus adaptés. Son coût reste toutefois supérieur au comptage cellulaire ; c’est pourquoi il n’est pas utilisé en routine, outre des contraintes de mise en œuvre. De plus, il faut être très vigilant lors du prélèvement qui doit être réalisé dans les meilleures conditions d’asepsie possible, afin d’éviter une contamination extérieure des échantillons de lait.

2.2.2.1. Méthode conventionnelle

Il s’agit de la technique de référence (59), dont le protocole a été établi par le National Mastitis Council (66). Elle permet d’identifier l’espèce bactérienne mais aussi d’avoir une estimation de la quantité de bactéries présente dans l’échantillon. Pour cela, une fraction de l’échantillon est étalée sur un milieu où les bactéries sont susceptibles de se développer et de se multiplier pour former des colonies ; le plus souvent, il s’agit d’une gélose au sang de mouton. Le nombre d’Unités Formant Colonies (UFC) visibles sur la gélose peut alors être déterminé. Cependant, on ne peut compter que 200 colonies au maximum sur une boite de Pétri, car au-delà les colonies sont trop proches les unes des autres pour être dénombrées. Cette méthode ne permet pas d’isoler les mycoplasmes, pour lesquels la méthode à utiliser est plus complexe et la culture plus longue.

Cependant, chaque bactérie présente dans l’échantillon ne va pas systématiquement se multiplier pour donner une colonie ; certaines vont mourir ou ne se multiplieront pas

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suffisamment pour être visible. En effet, une inhibition de la croissance peut être causée par une diminution du pH due à la fermentation de la flore contaminante (67). D’autres facteurs peuvent plus couramment être à l’origine de résultats faussement négatifs, tels qu’une antibiothérapie, une infection à germes intracellulaires, une excrétion intermittente et/ou en faible quantité d’un autre agent pathogène, une interaction avec les enzymes du lait ou une méthode bactériologique inadaptée. Ainsi le dénombrement est souvent largement sous- estimé.

A partir d’une colonie, il est également possible d’identifier l’espèce bactérienne grâce à des galeries constituées d’une série de tests biochimiques. En testant le type de colonie majoritaire sur la gélose, on peut ainsi déterminer l’espèce dominante dans l’échantillon.

Le risque d’un résultat faussement positif à la suite d’une contamination de l’échantillon doit aussi être considéré. Ainsi, certaines études ont proposé l’isolement de l’agent pathogène dans deux échantillons de lait consécutifs au minimum et espacés d’au moins 24 heures (68) ou l’association de la bactériologie conventionnelle à une numération cellulaire (69) pour considérer que l’infection est effectivement présente et réduire le risque de faux positifs. De plus, le délai pour l’obtention des résultats est long à cause du temps d’incubation nécessaire à la croissance des colonies sur la gélose qui est d’au moins β4-48 heures.

2.2.2.2. Méthode moléculaire par PCR quantitative

La bactériologie moléculaire repose sur des techniques de Polymerase Chain Reaction (PCR) et permet de donner une information quantitative sur la présence de bactéries, dont les mycoplasmes, dans l’échantillon. La technique de PCR quantitative (qPCR) repose sur l’amplification par polymérisation de l’ADN spécifique à une bactérie ou à une famille de bactéries. Avant d’utiliser la PCR, l’ADN doit être extrait à partir de l’échantillon de lait car celui-ci possède des substances pouvant inhiber la réaction de polymérisation (70). Cet ADN est placé dans un thermo cycleur où il va être amplifié. La multiplication des séquences cible d’ADN est exponentielle, car les séquences d’ADN dupliquées, appelées amplicons, au cours d’un cycle servent de base de duplication aux cycles suivants. Durant cette phase de duplication un marqueur chimique fluorescent se fixe aux amplicons. La fluorescence mesurée à la fin de chaque cycle est proportionnelle à la quantité d’amplicons générés. L’analyse de l’amplification consiste à déterminer après combien de cycles, le signal est

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significativement supérieur à un seuil fixé de façon arbitraire ; ce cycle nommé Ct pour cycle threshold est celui où la fluorescence est statistiquement et significativement plus élevée que le bruit de fond (71) (Figure 6). Plus un échantillon est initialement riche en ADN cible, moins le nombre de cycles nécessaire pour atteindre ce seuil est grand, donc plus le Ct sera faible. La valeur du Ct peut donc être traduite en un résultat quantitatif en comparant les valeurs de Ct obtenues avec celles d’une gamme dont la quantité de chaque point a été préalablement déterminée (72).

Figure 6 : Exemple de la détermination du Ct en fonction de la fluorescence et du nombre de cycles d’amplification

Il s’agit d’une méthode très sensible, spécifique car basée sur l’identité génétique de l’agent pathogène et qui est rapide. En effet, l’analyse d’un échantillon ne prend que γ à 4h avec les trousses commerciales (73). De plus cette méthode est pratique, car elle fonctionne aussi à partir d’échantillons ayant été congelés ou si on a eu recours à des agents de préservation (74).

L’inconvénient de cette technique est qu’elle ne permet de détecter qu’un nombre limité de types bactériens. Pour les échantillons de lait de vache, la détection de 11, voire 19 espèces bactériennes simultanément est actuellement possible. Cette trousse semble avoir une meilleure sensibilité que la bactériologie conventionnelle (89% des échantillons positifs contre 77%) mais le risque de faux positifs en raison d’une contamination est très élevé (75). Une étude chez les petits ruminants a donné des résultats similaires entre la bactériologie conventionnelle et cette trousse, dans 98,9 % des échantillons (69). Cela tient probablement à la nature des germes responsables des mammites chez les espèces de petits ruminants qui sont majoritairement des stahylocoques ou des streptocoques et plus rarement des pasteurelles. Enfin, pour palier au risque élevé de faux positifs, dû à la très grande sensibilité de cette

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technique, il est particulièrement important d’éviter toute contamination extérieure au moment du prélèvement et de la manipulation des échantillons (69, 76).

3. EPIDEMIOLOGIE DES MAMMITES CHEZ LA CHEVRE