Article II: The iron regulator hepcidin impairs macrophage dependent cardiac repair after injury

L'homéostasie efficace du fer est essentielle à l’équilibre cardiovasculaire. La carence en fer est fréquente chez les patients atteints de maladies coronariennes et augmente la morbidité chez les individus présentant des profils à risque élevé, en particulier chez les personnes atteintes de diabète. De même, chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque, l'anémie est fréquente et représente un facteur pronostique indépendant de la

mortalité, justifiant la recherche sur des thérapies modulant le métabolisme du fer 502, 503. À

l'inverse, l'excès de fer est également préjudiciable à la fonction cardiaque. La cardiomyopathie par surcharge de fer est la cause la plus fréquente de mortalité chez les patients souffrant de surcharge de fer secondaire ou primaire chez les patients atteints d'hémochromatose génétique.

Parmi les multiples régulateurs de l'homéostasie du fer, l'hepcidine joue un rôle essentiel dans la régulation systémique du fer en modulant le transfert du fer alimentaire, recyclé et

stocké des compartiments intracellulaires aux fluides extracellulaires 504. L'hepcidine se lie à

l'exportateur de fer à la surface des cellules, la ferroportine (FPN), induisant son internalisation et sa dégradation, engouffrant ainsi le fer à l’intérieur de la cellule 320. Dans le cœur adulte, la suppression spécifique de l'hepcidine ou de la FPN par les cardiomyocytes n'a pas d’effet sur le fer systémique, mais plutôt sur la teneur en fer cardiaque, ce qui

entraîne une dysfonction cardiaque à long terme 505, 506. Dans les modèles expérimentaux de

myocardite auto-immune, l'hepcidine est élevée 330. Notamment, les taux d'ARNm de Hamp

sont augmentés en réponse à l'interleukine IL-6 et aux agents pathogènes liés au récepteur (TLR) 4 dans les macrophages cultivés 305, 507 De façon remarquable, seuls les taux de transcription de Hamp sont régulés de manière transitoire dans le myocarde ischémique alors que ceux d'autres gènes liés au fer, tels que l'hémojuveline et l'IREG-1, ne sont pas affectés 508.

Compte tenu du rôle de l'hepcidine dans la régulation locale de la fonction cardiaque et de l’inflammation dans le remodelage et la fonction cardiaque après un infarctus aigu du myocarde (AMI), nous avons émis l'hypothèse que les macrophages inflammatoires dans les cœurs infarcis pourraient favoriser l'expression de l'hepcidine, pour contrôler localement la réparation cardiaque.

• L'hepcidine contrôle localement la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde, indépendamment de ses effets systémiques sur les taux de fer

Afin d'évaluer le rôle local de l'hepcidine dans l'homéostasie cardiaque, nous avons utilisé des souris déficientes pour l'hepcidine (Hamp - / -) puis nous avons effectué une ligature permanente de l'artère coronaire gauche pour induire l'IM. Nous avons d'abord montré que l'IM favorise la régulation à la hausse des niveaux protéiques ainsi que de l'ARNm d’Hamp dans le cœur et le sang des animaux ayant subi un infarctus dès les premiers jours après

l'ischémie. Alors que la fonction cardiaque était similaire chez les animaux Hamp - / - et WT

pendant les premières semaines suivant le début de l'ischémie, la carence en hepcidine a

amélioré de manière inattendue la fonction cardiaque à partir du 56ème jour après l'induction

de l'IM par rapport aux souris WT. Chez les souris Hamp-/-, l'augmentation de la fraction de

raccourcissement du ventricule gauche (FR) était subordonnée à une réduction du diamètre interne systolique du ventricule gauche (LVID) et à l'amélioration de l'épaisseur de la paroi postérieure diastolique et systolique du ventricule gauche (LVPWd, LVPW). Ces effets sont associés à une réduction de 2,9 et 2,7 fois de la taille de l'infarctus et de la fibrose interstitielle, respectivement, sans aucune modification de la densité capillaire. Nous avons d'abord émis l’hypothèse que les altérations systémiques du fer induites par une déficience en hepcidine participent à la récupération de la fonction cardiaque et à l'abrogation du remodelage défavorable du VG. Pour étudier ce point, nous avons utilisé des souris WT alimentées par des régimes standard (contrôles), appauvris en fer ou supplémentés en fer. Comme prévu, les différents types de régimes ont eu une incidence sur l'accumulation de fer dans le tissu cardiaque et dans le foie. Néanmoins, indépendamment du degré d'accumulation du fer dans le cœur, nous n'avons pas pu détecter d'effets positifs sur la fonction cardiaque et le remodelage quel que soit le temps après l'ischémie. L'hepcidine est fortement exprimée par les cardiomyocytes. Nous avons ensuite émis l'hypothèse que l'hepcidine dérivée des cardiomyocytes était une composante intégrale de la régulation de la fonction cardiaque. Nous avons donc développé des souris avec une déplétion spécifique de

l'hepcidine dans les cardiomyocytes (αMHC-Cre +/Hampf/f). Nous n'avons pas été en mesure

d’observer des effets bénéfiques sur la fonction cardiaque, ce qui suggère que l'hepcidine endogène des cardiomyocytes n’est pas impliquée dans la récupération de la fonction cardiaque dans nos conditions expérimentales.

• L'hepcidine dérivée des macrophages dirige le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde

L’IM stimule et orchestre l'inflammation dans le tissu cardiaque. L’inflammation régule le dépôt local de la MEC, le remodelage vasculaire, la taille de l'infarctus et la survie des

cardiomyocytes 199, 509. Comme le compartiment de la moelle osseuse (BM) est la principale

source de cellules inflammatoires cardiaques chez les souris adultes atteintes d'IM, nous avons d'abord évalué le rôle des cellules inflammatoires dérivées de la moelle osseuse exprimant l'hepcidine. Nous avons donc généré des souris chimériques WT irradiées et transplantées avec des cellules dérivées de moelle osseuse d'animaux WT ou déficients en hepcidine. Après l'induction de l'IM, nous avons montré que la fonction cardiaque était

meilleure chez les souris WT transplantées avec des cellules Hamp-/ - dérivées de la moelle

osseuse par rapport aux chimères WT. La taille des infarctus et la teneur en collagène étaient respectivement 1,7 et 1,5 fois réduites, chez les souris WT transplantées avec la moelle Hamp - / - par rapport à celles qui recevaient la moelle WT. Nous avons ensuite cherché à identifier le type de cellules inflammatoires exprimant l'hepcidine dans le cœur ischémique. En utilisant des cellules triées par cytométrie en flux, nous avons montré que les niveaux d'ARNm de Hamp étaient principalement détectés dans les MO/Mϕ Ly6C + cardiaques (CD45 + / CD11b + / Ly6G-). Pour évaluer le rôle des MO/Mϕ exprimant l'hepcidine, nous avons ensuite généré des souris avec une déplétion spécifique de l'hepcidine dans les cellules myéloïdes (LysMCre +/Hampf/f). De manière intéressante, les

souris WT chimériques reconstituées avec des cellules LysMCre +/Hampf/f ont montré une

fonction cardiaque nettement améliorée par rapport aux souris WT chimériques

transplantées avec des cellules de la moelle LysMCre +/Hampwt/f. La récupération de la

fonction cardiaque a été associée à la réduction de la taille de l'infarctus et de la teneur en collagène.

• Les macrophages déficients pour hepcidine induisent la régénération cardiaque.

Le schéma à long terme de la récupération cardiaque nous invite à spéculer qu'une partie de l'effet bénéfique du déficit en hepcidine pourrait reposer sur la stimulation du renouvellement des cardiomyocytes endogènes. En effet, des études récentes révèlent que le renouvellement des cardiomyocytes peut se produire pendant la vie adulte, y compris

cardiomyocytes était en effet augmenté dans le cœur ischémique des souris ayant une déficience d’hepcidine dans les MO/Mϕ. La mitose des cardiomyocytes et la cytokinèse ont également été évaluées par co-localisation de la phosphorylation d’histone H3 (pH3) et de la kinase Aurora B, respectivement, avec la troponine T. Nous avons trouvé un nombre significativement plus élevé de cardiomyocytes positifs pour pH3 et Aurora B dans des cœurs

infarcis des souris LysMCre + /Hampf/f par rapport aux souris contrôles WT. Étant donné le

faible taux d'achèvement du cycle cellulaire des cardiomyocytes dans nos conditions expérimentales, nous avons utilisé un modèle distinct de régénération cardiaque chez les nouveaux-nés où la régénération cardiaque est induite par une atteinte cardiaque consécutive à une résection apicale. En effet, le cœur de souris néonatal affiche un potentiel de régénération transitoire et constitue un modèle précieux pour déchiffrer l'interaction

entre l'inflammation et la régénération cardiaque des mammifères 261. La carence en

hepcidine dans les MO/Mϕ accélère la régénération cardiaque, traduite par une réduction de la taille de la cicatrice par rapport aux contrôles au 7ème jour après la résection apicale.

• L’hepcidine dérivée des macrophages dirige la réparation cardiaque à travers la libération d’IL-4/IL-13.

Nous avons ensuite tenté de mettre en évidence l'activateur principal de l'expression de l'hepcidine dans les macrophages. Les macrophages ont été différenciés in vitro à partir des cellules dérivées de BM cultivées et isolées des animaux LysMCre +/ Hampwt/f ou LysMCre

+/Hampf/f et traités avec des facteurs bien connus impliqués dans la régulation du

phénotype inflammatoire des macrophages, comme le LPS, l'IL-4 et IL-10. Nous avons observé que les niveaux d'ARNm de Hamp étaient exclusivement et nettement augmentés dans les macrophages traités par LPS. En l'absence d'hepcidine, nous avons spéculé que l'augmentation induite par le LPS du nombre de macrophages CD45 + / CD11b + / F4 / 80 + / CD64 + / MHCIIlow pourrait être associée à la modification du répertoire des médiateurs inflammatoires classiques. Nous avons montré que les macrophages déficients en hepcidine traités par LPS ont libéré une quantité plus élevée d'IL-13 et d'IL-4, par rapport aux macrophages WT traités par LPS. Les niveaux d'ARNm de l’IL-13 et de l’IL-4 sont augmentés

dans le tissu cardiaque des animaux LysMCre + / Hampf/f par rapport à celui des LysMCre + /

Hampwt / f, 3 ou 7 jours après la blessure. Nous avons alors cherché à montrer que le couple IL-4 / IL-13 dérivés de macrophages régit la réparation cardiaque. À cette fin, nous avons

généré des souris présentant une déficience à la fois de l'hepcidine et de l'IL-4 / IL-13 dans la lignée myéloïde (LysMCre +/ Hampf/f / IL4-IL13f/f). Nous avons montré que la fonction cardiaque était plus altérée dans le groupe de souris LysMCre + / Hampf/f / IL4-IL13f/f par rapport aux souris LysMCre + / Hampf/f / IL4-IL13wt/wt. Cet effet est associé à une augmentation de la taille de l'infarctus et de la fibrose interstitielle suggérant que la libération d'IL-4 / IL-13 par les Mφ cardiaques déficients en hepcidine favorise la réparation cardiaque. Enfin, nous avons évalué le processus de régénération cardiaque après une lésion

cardiaque induite par résection apicale chez les nouveaux-nés LysMCre +/ Hamp f/f/ IL4-

IL13f/f. De façon remarquable, la carence en hepcidine et en IL-4 / IL-13 dans les

macrophages a totalement inhibé la régénération cardiaque comme révélée par la diminution du taux de survie dès le premier jour après la résection apicale. La plupart des

nouveau-né LysMCre +/ Hamp f/f/ IL4-IL13f/f ont subi une rupture cardiaque sévère.

Dans ce deuxième travail, nous avons donc démontré un rôle nouveau et inattendu du régulateur de fer, l’hepcidine, dans le contrôle de la capacité d'un sous-ensemble spécifique de macrophages à moduler la sécrétion d'IL-4 et d'IL-13 et, par la suite, d'avoir un impact sur la réparation cardiaque après une blessure.

The iron regulator hepcidin impairs macrophage dependent cardiac repair after injury

Ivana Zlatanova1, Cristina Pinto1, Philippe Bonnin2, Jacques RR Mathieu3, Wineke Bakker1, Jose Vilar1, Mathilde Lemitre1, David Voehringer4, Sophie Vaulont3, Carole Peyssonnaux3,

Jean-Sébastien Silvestre1

1

Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMRS-970, Paris Centre de Recherche Cardiovasculaire, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, F-75015 Paris, France

2

INSERM, Unit 965, Départment de physiologie Clinique, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, Hôpital Lariboisière, F-75010 Paris 3 INSERM U1016, CNRS UMR 8104, Institut Cochin, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, F-75014 Paris, France 4 University Hospital Erlangen, Wasserturmstrasse 3/5, D-91054 Erlangen, Germany

Corresponding author: Jean-Sébastien Silvestre, PhD, PARCC-Inserm U970, Paris Descartes University, 56 Rue Leblanc, 75015 Paris, France; e-mail: jean-sebastien.silvestre@inserm.fr; Phone Number: 33 1 53 98 80 60; Fax Number: 33 1 53 98 79 51

Abstract

Defective systemic and local iron metabolism correlates with cardiac disorders. Hepcidin, a master iron sensor, actively tunes iron trafficking. We hypothesized that hepcidin could play a key role to locally regulate cardiac homeostasis following acute myocardial infarction (AMI). Here, we found that the expression of hepcidin was elevated after AMI and unexpectedly its complete deficiency restored cardiac function. Modulation of systemic iron levels or the specific genetic disruption of hepcidin in cardiomyocytes failed to recapitulate the deleterious effects of hepcidin. In contrast, hepcidin expressed by inflammatory macrophages tuned the number of a distinct pool of macrophages characterized by CD45+/CD11b+/F4/80+/CD64+/MHCIILow/CCR2+ in both cardiac-sorted populations and LPS- treated bone marrow derived macrophages. These data suggested that hepcidin expressed by cardiac macrophages was instrumental in shaping the dysfunctional heart. Notably,

transplantation of bone marrow derived cells from hepcidin deficient (Hamp-/-) mice or from

LysM-Cre+/Hampf/f animals remarkably improved cardiac function. This effect was associated

with a robust reduction in the infarct size, tissue fibrosis and unforeseen stimulation of cardiomyocyte renewal. Similarly, in a prototypic model of apical resection-induced cardiac regeneration in neonatal mice, we unraveled that macrophages lacking hepcidin fostered cardiomyocyte proliferation. Remarkably, hepcidin-deficient macrophages induced the potent release of IL-4 and IL-13 via their iron metabolism. Strikingly, the combined genetic suppression of hepcidin and IL-4 or IL-13 in macrophage failed to improve cardiac function and recovery in both adult and neonatal injured hearts. In conclusion, hepcidin commands macrophage-induced cardiac repair and regeneration through an IL-4/IL-13 related pathway.

Effective iron homeostasis is essential to cardiovascular health. Iron deficiency is frequent in patients with coronary artery diseases and increases morbidity in individuals with high risk

profiles, especially for people with diabetes 1. Likewise, in patients with heart failure, anemia

is common and an independent prognostic factor for mortality prompting the development of iron therapy in affected individuals 1 2 3. Conversely, excess iron is also detrimental to cardiac function. As such, iron-overload cardiomyopathy is the most common cause of mortality in patients with secondary iron-overload, and is a major co-morbidity in patients with genetic hemochromatosis 4 5 6.

Among the multiple regulators of iron homeostasis, hepcidin plays an instrumental role fine- tuning systemic iron trafficking by modulating the transfer of dietary, recycled and stored

iron from intracellular compartments to extracellular fluids 7. Hepcidin is a cationic peptide

hormone produced essentially by hepatocytes but also by other professional iron regulatory cells such as macrophages. Hepcidin binds to the cell surface iron exporter, ferroportin,

inducing its internalization and degradation, thus blunting iron efflux 8. Consistent with this,

hepcidin-deficient mice or human with ferroportin variants resistant to hepcidin-induced

degradation become iron loaded 9 10. Conversely, severe iron deficiency anaemia is observed

in mice or human overexpressing hepcidin 9 11. Hepcidin synthesis is down-regulated by iron

deficiency, hypoxia and erythropoietic drive 12, whereas increase in iron, bone morphogenic

protein signaling pathway and endoplasmic reticulum stress enhance mRNA levels of Hamp,

the gene encoding hepcidin 13.

Strikingly, hepcidin is also localized in tissues including the brain, the kidney, the placenta and the heart 14 15 with no cherished role in systemic iron trafficking suggesting that the extra-hepatic pool of hepcidin is instrumental to locally regulate tissue iron homeostasis. Importantly, in the healthy adult heart, cardiomyocyte-specific deletion of hepcidin or ferroportin did not regulate systemic iron flux but rather directed cardiac iron content leading to long term heart dysfunction 15 16. In experimental models of pro-inflammatory

autoimmune myocarditis, the expression of hepcidin was elevated. 14. Notably, Hamp mRNA

levels were increased in response to interleukin (IL)-6, and to toll-like receptor (TLR) 4

binding-pathogens in cultured macrophages 17 18. Remarkably, only Hamp transcript levels

were transiently upregulated in the ischemic myocardium whereas that of other iron-related genes, such as hemojuvelin and IREG-1, were unaffected 19. Given the role of hepcidin to locally regulate cardiac function, and that inflammation guides cardiac remodeling and function after acute myocardial infarction (AMI), we hypothesized that the inflammatory macrophages harbored within the infarcted heart may foster the expression of hepcidin, to locally steer cardiac repair. So far, the role of hepcidin in cardiac diseases challenged by inflammation remained unexplored. Using newly developed mouse models of hepcidin deficiency, we showed that hepcidin controls iron metabolism in a specific subset of

CD45+/CD11b+/F4/80+/CD64+/MHCIILow/CCR2+ cardiac inflammatory macrophages leading to

the unexpected modulation of IL-4 and IL-13 secretion and subsequent robust effect on both cardiac healing and regeneration after heart injury.

Results Hepcidin locally controls cardiac function after myocardial infarction, independently of its systemic iron handling effects In order to assess the local role of hepcidin in cardiac homeostasis, we used mice deficient for hepcidin (Hamp -/-) and challenged them with coronary artery ligature to induce AMI. We first showed that AMI promoted upregulation of Hamp mRNA and Hepcidin protein levels in both infarcted heart and blood, as early as day 1 after the onset of ischemia (Figure 1A). Whereas cardiac function was similar in Hamp-/- and WT littermates during the first weeks following the onset of ischemia, hepcidin deficiency unexpectedly improved cardiac function from day 56 onward after the induction of AMI when compared to control mice (Figure 1B). In Hamp null mice, the increase in the left ventricular fractional shortening (FS) was subordinated to a reduction in the systolic left ventricular internal diameter (LVIDs), and improvement of both diastolic and systolic left ventricular posterior wall thickness (LVPWd, LVPWs) (Figure 1B). These effects were associated with a 2.9 and 2.7 reduction in infarct size and interstitial fibrosis, respectively without any modifications of the capillary density (Figure 1C-1E).

Hepcidin is a master regulator of iron trafficking and hepcidin deficiency correlated with iron accumulation in both the non-infarcted and infarcted myocardium as well as in the liver (Figure 2A). Iron is a constituent of hemoproteins, iron-sulfur proteins, and other functional groups that are essential for cellular functions. We first speculated that systemic iron alterations induced by hepcidin deficiency participated to cardiac function recovery and abrogation of the adverse left ventricular remodeling. To address this point, we used wild- type mice fed with control, iron depleted or iron supplemented diets. As expected, the different types of diets impacted iron accumulation in the cardiac tissue and in the liver (Figure 2B). Nevertheless, independent of the degree of iron accumulation in the heart, we were not able to detect any positive effects on both cardiac function and remodeling whatever the time after ischemia (Figure 2C). Altogether, these results suggested that defective systemic iron metabolism did not participate to cardiac function recovery in Hamp- /-

mice and that hepcidin locally governed cardiac homeostasis.

Hepcidin was robustly expressed by cardiomyocytes. We then hypothesized that cardiomyocyte-derived hepcidin was an integral component of cardiac function regulation. We therefore developed mice with specific deletion of hepcidin in cardiomyocytes (αMHC-

Cre+/Hampf/f) (Figure 2D). Whereas a marked reduction in hepcidin expression was achieved

in the cardiac tissue of αMHC-Cre+/Hampf/f mice, we were not able to uncover any effects on cardiac function and healing suggesting that cardiomyocyte endogenously-derived hepcidin was not involved in cardiac function recovery in our experimental conditions (Figure 2D).

Macrophage-derived hepcidin directs cardiac remodeling after myocardial infarction

Myocardial infarction stimulates orchestrated waves of inflammation in the cardiac tissue, which by regulating local matrix deposition, vascular remodeling, infarct size and

cardiomyocyte survival/hypertrophy mediate injury repair and determine heart function 20 21

22

. In particular, it is now well documented that injury signals can guide either direct recruitment of immune/inflammatory cells to the infarcted tissue from bone marrow- or spleen-derived circulating cells, or regulate their local activation and proliferation processes.