~ 129 ~ naissances avant terme
IV. Approches méthodologiques
Pour répondre à ces objectifs de travail de thèse, un total de 39 placentas de femmes témoins et 29 placentas de femmes obèses ont été collectés. Des fragments placentaires ont été prélevés de manière standardisée sur toute l’épaisseur du placenta au centre du disque placentaire.
Le premier objectif visant à caractériser de manière approfondie les placentas de femmes obèses comprend le recrutement de 36 patientes dans le groupe contrôle et 24 patientes dans le groupe obèses pour l’ensemble de l’étude. La mesure de la biométrie placentaire a été réalisée par une approche de stéréologie à partir de coupes histologiques réalisées sur l’entière épaisseur du placenta collecté et colorées à l’éosine et hématoxyline. Le volume et la surface des composants structuraux des placentas (trophoblaste, chambre intervilleuse, vaisseaux fœtaux, mésenchyme, nœuds et fibrine) ont été mesurés par le logiciel Mercator sur 4 à 5 coupes histologiques par placenta collectés (8 contrôles et 8 obèses). De plus, nous nous sommes focalisés sur les vaisseaux fœtaux en utilisant un marquage à l’aide de deux
~ 145 ~
anticorps dirigés spécifiquement contre les cellules endothéliales sur des coupes histologiques issues de 8 placentas de femmes contrôles et de 8 placentas de femmes obèses.
Toujours dans le premier objectif, nous avons étudié le statut inflammatoire placentaire. A partir d’explants issus de 5 placentas du groupe contrôle et 5 placentas du groupe « obèse » cultivés pendant 48h, nous avons mesuré la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, TNF-α, IL-1β, leptine, IL-10, MCP-1) par une technique d’analyse ELISA multiplex. Pour compléter cette approche, nous nous sommes intéressés aux cellules immunitaires présentes dans les tissus placentaires. Sur des coupes histologiques réalisées sur l’entière épaisseur de 8 placentas de femmes témoins et de 8 placentas de femmes obèses, nous avons effectué un marquage immunologique spécifique des monocytes, des macrophages et des leucocytes (comprenant les LT et les LB). Les cellules positives ont été quantifiées via le logiciel Aperio Imagescope. L’activation des voies de signalisation a également été mesurée via la quantification des protéines ERK, JNK et JAK phosphorylées et totales par immunoblot. Enfin, par des approches de qPCR et d’immunoblot sur 8 placentas de femmes contrôles et 8 placentas de femmes obèses, nous avons mesuré l’expression des transporteurs du glucose (GLUT1/3) et des acides aminés (LAT1/2, SNAT1/2). Pour compléter cette approche, nous avons mesuré l’efficacité du transfert placentaire des nutriments par une approche de perfusion placentaire sur cotylédons isolés à partir des placentas de femmes contrôles et obèses. La perfusion du placenta permet de reproduire ex-vivo la circulation foeto-maternelle
~ 146 ~
Figure 44 : Schéma de la perfusion placentaire
Le compartiment fœtal contient un milieu restituant les conditions physiologiques. Ce compartiment perfuse le cotylédon via une artère et une veine cathétérisées. Le compartiment maternel contient un milieu similaire au compartiment fœtal où sont ajoutées nos molécules d’intérêt. Le retour veineux fœtal comprend le milieu après perfusion du placenta et échange avec le milieu maternel. Il est récupéré au cours des 90 mintues de perfusion et dosé pour la mesure du passage des molécules d’interêt.
La fonction endocrine a également été évaluée par l’étude de l’expression de l’ARNm de la leptine et de la sécrétion de l’hCG dans des CTV isolés à partir de placenta de femmes contrôles et obèses après 72h de culture (n = 8 pour les deux groupes).
Le deuxième objectif visant à étudier l’expression des systèmes leptine et adiponectine comprend le recrutement de 18 patientes témoins et 12 patientes obèses pour l’ensemble de l’approche. L’étude a débuté par l’analyse en qPCR et immunoblot de l’expression de la leptine, du récepteur de la leptine (LEPR), des récepteurs de l’adiponectine (ADIPOR1/2), sur des biopsies placentaires collectées précisément sur les faces fœtales et maternelles de 9 placentas issus de femmes contrôles et 9 placentas de femmes obèses. Par la suite, nous nous sommes intéressés aux mécanismes potentiellement impliqués dans la modulation de l’expression des systèmes leptine et adiponectine par une approche épigénétique. Pour cela, nous avons mesuré les taux de méthylation des régions promotrices de nos gènes d’intérêt, à savoir le gène LEP, ADIPOQ, LEPR, ADIPOR1/2 par PCR et pyroséquençage.
V. Collaborations
L’ensemble des expérimentations a été réalisé sur des placentas à terme issus de césariennes programmées au CHI de Poissy-Saint-Germain-en-Laye (CHIPSG). Les prélèvements sanguins maternels au sein de notre population de femmes obèses ont également été réalisés au CHIPSG. Les lames et les marquages histologiques ont été réalisés par le service d’anatomie pathologique du CHIPSG. Ainsi, le bon déroulement de cette thèse est avant tout
~ 147 ~
lié au dialogue permanant et à la volonté du personnel du CHIPSG (médecins, sages-femmes, personnel soignant), qui a permis le recrutement des femmes incluses dans cette étude et la réalisation de l’ensemble des gestes médicaux nous permettant d’obtenir les prélèvements dont nous avions besoin.
Les analyses épigénétiques ont été réalisées en étroite collaboration avec l’équipe « Mécanismes épigénétiques et construction-prédiction des phénotypes » de l’unité mixte de recherche (UMR) biologie du développement et reproduction (BDR) de l’INRA de Jouy-en-Josas. Les analyses de stéréologie ont également été réalisées en collaboration avec l’équipe « Placenta, environnement et programmation des phénotypes » de l’UMR BDR. Ainsi, c’est par le dialogue et le partage des connaissances avec les équipes de chercheurs de la BDR que j’ai pu réaliser une partie de cette étude.
La plateforme de perfusion placentaire a été mise en place à l’UFR Simone Veil-Santé par le Dr Paul Berveiller de notre équipe GIG au cours de l’année 2017 avec l’aide de l’UMR-S1139 « Physiopathologie & Pharmacotoxicologie Placentaire Humaine/Microbiote Pré & Postnatal » de l’Université Paris Descartes.