Apport de l’immunoaffinité pour l’extraction de la BuChE du plasma

En alternative aux supports de procainamide préalablement cités, un support d’immunoextraction a été développé par Sporty et al. [10] en 2010 et reprise par de nombreuses équipes [14, 18, 87, 101–108]. Cette méthode est basée sur l’immobilisation non covalente d’anticorps anti-BuChE sur des billes magnétiques activées par de la protéine G ou de la streptavidine [14]. Ces billes sont mises en contact avec le plasma et permettent ainsi le piégeage de la BuChE. Après ces étapes de préparation du support et d’incubation, (généralement 4 h), les billes sont isolées puis mises en contact avec une solution de protéase pendant un temps variant de 30 à 180 minutes (Tableau 5). Cela permet de générer les adduits

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peptidiques associés aux OPNA, qui sont ensuite analysés par LC-MS². Cette purification de la BuChE par billes immunomagnétiques est plus spécifique que les approches précédentes et requiert de faibles quantités de plasma. Cependant, hormis les travaux réalisés par Marsillach [101] et Aryal et al. [14] qui procèdent à une étape intermédiaire d’élution de la BuChE des supports d’immunoaffinité (Figure 21), la majorité des protocoles implique d’utiliser pour chaque échantillon un nouveau lot d’anticorps puisqu’ils sont digérés par la protéase [10, 18, 102–104]. De ce fait, l’étape de digestion conduit à des peptides issus de la BuChE, des anticorps, de la protéine G, de la protéase par autodigestion et donc à de nombreux peptides qui pouvant affecter la réponse en spectrométrie de masse des adduits peptidiques ciblés.

Figure 21 : Illustration schématique de la procédure d’extraction et de digestion de la BuChE avant l’analyse par LC-MS². La BuChE est extraite par un complexe anticorps-biotine fixé à des billes

magnétiques de streptavidine et digérée avec de la trypsine. Adapté de [14].

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La récupération des protéines avant la digestion semble être le choix le plus judicieux pour réduire la présence de peptides non désirés. Néanmoins, l’ensemble des protocoles comporte une étape de digestion effectuée en solution qui génère malgré tout des peptides issus de l’autodigestion de l’enzyme. De plus, aucune information n’a été donnée concernant la répétabilité de l’immunoextraction, le nombre de réutilisations possibles ou les conditions de fixation et de récupération optimales de la BuChE sur les billes immunomagnétiques.

Globalement, le protocole d’immunoextraction ne semble pas avoir été optimisé. Très peu d’équipes fournissent une information sur les taux de fixation [87, 101, 104] et hormis un test SDS-PAGE pour estimer visuellement la purification de la BuChE après immunoextraction [14, 101], aucune valeur n’apparait dans les publications concernant les taux de récupération de la BuChE après élution du complexe immunomagnétique. Une réutilisation du support immunomagnétique après élution de la protéine a été évoquée sans fournir plus de détail [102]. L’immobilisation des anticorps sur les billes magnétiques étant non covalente, la faible stabilité des anticorps sur le support peut rendre difficile l’obtention d’extractions reproductibles, la dissociation du complexe BuChE-anticorps risquant de fragiliser la liaison bille-anticorps. Par ailleurs, l’étape de récupération et de digestion en solution empêche toute automatisation de l’extraction [102].

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5Tableau 5 : Liste des conditions d’immunoextraction sur billes magnétiques, de digestion et d’analyse de la BuChE de plasma ou sérum humain.

Echantillon Anticorps Support des anticorps

-Colonne : remplie C12 (Jupiter 4µm, Proteo 90A, 30 cm x 75 d.i) remplie avec silice C18 (Jupiter 3 µm)

-ρm : 300 nL.min^-1, Eau/ACN (0,1% A.F.), gradient, 150 min -LTQ orbitrap+ Western Blot - Q Trap quadripole linear ion trap, API

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Echantillon Anticorps Support des anticorps

-Colonne : Acquity BEH C18, (50 x 2.1 mm, 1.7 µm)

-Colonne Aquasil C-18 (1 mm x 50 mm, 3 µm)

-Colonne : Restek Pinnacle DB Biphenyl (50 x 2,1 mm, 1,7 µm), 60°C

-ρm : 300µL.min^-1, eau/ACN (0,1% A.F.), gradient, 2.4 min - Triple quadripole ESI+, MRM

- Quantification par droites d’étalonnage (2-250 ng/mL) du nonapeptide non adduit et du nonapeptide avec adduits vieillis

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Echantillon Anticorps Support des anticorps

-Colonne : Restek Pinnacle DB Biphenyl (50 x 2,1 mm, 1,7 µm, et adduit par les OPNA (VX, VR, GB, GE, GF,

* : non spécifié, Ac : anticorps, A.F : acide formique, E.I : étalon interne, EtP : phosphonate d’éthyle, ExP: phosphoryle d’éthyle, GB : Sarin, GD : soman, GE : ethyl sarin, GF : cyclohexyl sarin, IMS : séparation immunomagnétique, MeP: phosphonate de méthyle, N.C : Non communiqué, P-BuChE : BuChE

phosphorylée, ρm: phase mobile, PrP : phosphonate de propyle, VR : VX russe

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Aussi, Schopfer et al. [52] ont immobilisé de façon covalente des anticorps monoclonaux anti-BuChE (mAb2 [52] ou B2 18-5 [109]) sur des billes de sépharose activée CNBr. Après mise en contact de 500 µL de plasma avec 40 µL de billes immunomagnétiques pendant une nuit, la BuChE est désorbée des billes par de l’acide acétique (50 µL, 0.4 mol.L^-1, pH 2.6) puis digérée en solution par de la pepsine ou conservée pour un test SDS-PAGE [52]. Le test SDS-PAGE permet de montrer la présence du monomère et du dimère de BuChE mais révèle aussi la présence de protéines contaminantes (albumine et immunoglobulines principalement), indiquant que la méthode d’extraction développée n’est pas entièrement sélective, ceci pouvant s’expliquer par l’absence d’optimisation de l’étape de lavage. La mesure de l’activité enzymatique de la BuChE restant dans le plasma après purification a permis d’estimer que 95 à 98% de la BuChE s’était fixée aux anticorps mais aucune information n’est donnée concernant les taux de récupération de la BuChE du plasma après lavage et désorption. La digestion de la BuChE après purification est effectuée en solution à 37 °C pendant 2 heures par 2 µg de pepsine préparée dans 5% d’acide formique. Les peptides sont séparés de l’enzyme et des protéines non digérées par plusieurs étapes de lavage, filtration et centrifugation avant d’être analysés qualitativement par LC-MS².

En dépit de l’utilisation d’anticorps ayant une forte affinité pour la BuChE, ces méthodes d’immunopurification de la BuChE restent basées sur un simple phénomène de partage entre la BuChE de plasma et les anticorps. Néanmoins, le greffage covalent utilisé pour immobiliser les anticorps sur les billes de sépharose est un point fort dans une optique de réutilisation, bien que cet aspect n’ait pas été clairement décrit dans ces travaux. L’étape d’immunoextraction nécessite encore d’être étudiée plus en détail et optimisée en termes de sélectivité (comme le montre la présence de protéines contaminantes sur les tests SDS-PAGE) pour en faire une méthode d’extraction quantitative fiable, pouvant être couplée à l’étape de digestion et à l’analyse par LC-MS². Compte tenu de la complexité des échantillons biologiques, un grand soin devra être porté à l’optimisation du protocole d’immunoextraction afin de séparer efficacement la protéine d’intérêt sans endommager le support immunoadsorbant. Outre l’étape d’extraction, l’analyse d’une protéine par spectrométrie de masse inclut une étape de digestion, qui peut être effectuée en solution ou sur support d’enzymes immbilisées, appelé réacteur enzymatique.

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