CHAPITRE I - BUTYRYLCHOLINESTERASE, ENZYME BIOMARQUEUR
4. Analyse des adduits OPNA-BuChE par LC-MS 2
La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est devenue un outil important pour la biosurveillance d’adduits OPNA-BuChE [9, 48]. En effet, l’adduit formé par la fixation de l’OPNA sur la sérine 198 du site actif de la BuChE est très stable dans le sang, ce qui permet de détecter la présence d’OPNA jusqu’à plusieurs mois après l’exposition. Dans le cas d’une digestion à la pepsine, la BuChE adduite produit le peptide FGE198SOPNAAGAAS, comportant l’OPNA lié à la sérine 198. Ce peptide de neuf acides aminés, appelé nonapeptide, va ainsi permettre d’identifier et de quantifier les composés organophosphorés sous formes adduites grâce à l’utilisation de la chromatographie en phase liquide coupléee à la spectrométrie de masse en tandem [48]. La séparation du nonapeptide intact ou adduit par les différents OPNA est réalisée en chromatographie de phase inverse, à l’aide d’une colonne apolaire de type C18. Celle-ci permet de séparer et d’éluer les peptides par ordre de polarité croissante avant leur détection par spectrométrie de masse.
Le spectromètre de masse se compose de trois parties. La source d’ionisation permet de vaporiser et d’ioniser les molécules tandis que l’analyseur permet de séparer les ions en fonction de leur rapport masse sur charge (m/z) grâce à l’action d’un champ électrique et/ou magnétique. Finalement, le détecteur permet de transformer les ions ainsi formés en signal électrique. Plusieurs sources d’ionisation peuvent être utilisées, mais l’électronébulisation, également appelée ionisation par electrospray (ESI), est généralement préférée pour l’ionisation de grosses molécules telles que les peptides. En effet, ce type d’ionisation douce est peu énergétique, ce qui va permettre de transformer les ions présents à l’état liquide en ions en phase gazeuse sans risques de fragmentation. A l’issu du processus d’ionisation, les ions sont majoritairement présents sous forme monochargée, mais des espèces multichargées ou des adduits peuvent également être observés. Une fois les ions formés, ils sont transférés
Figure 13. Digestion de l’adduit OPNA-BuChE par la pepsine menant à un nonapeptide contenant l’OPNA.
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vers l’analyseur. De nombreux analyseurs sont disponibles tels que le piège à ions, l’analyseur à temps de vol, l’analyseur à résonnance cyclotronique ionique à transformée de Fourrier ou encore le quadripôle. Il est possible d’associer plusieurs analyseurs en série pour fragmenter les ions dans l’analyseur, on parle alors de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS ou MS2). L’association de trois quadripôles en séries permet de former un triple quadripôle détaillé Figure 14.
La spectrométrie de masse en tandem permet notamment de quantifier et de déterminer la séquence en acides aminés d’un peptide, grâce à l’analyse de ses ions fragments (ions fils). Les ions parents sont sélectionnés par un premier quadripôle (Q1) en fonction de leurs rapports m/z, fragmentés dans une cellule de collision (q) par un gaz inerte puis les ions fils sont analysés dans un second quadripôle (Q2) pour donner les spectres de collision de chaque ion parent. Plusieurs modes de détection peuvent être utilisés en mode MS/MS. Le mode Product Ion permet de détecter tous les ions fragments issus de l’ion parent tandis que le mode MRM (Multiple Reaction Monitoring) permet de détecter un ion fragment provenant d’un ion précurseur. Ce dernier mode apporte un gain en sélectivité et en sensibilité en diminuant le bruit de fond et peut être utilisé pour la quantification de molécules à l’état de trace dans des échantillons complexes. Typiquement, l’ion produit le plus intense est utilisé pour quantifier tandis que les second et troisième signaux les plus intenses sont utilisés en tant qu’ions qualitatifs pour confirmer l’identité de l’analyte. Les fragments principaux obtenus en spectrométrie de masse en tandem proviennent du clivage de la chaine peptidique principale au niveau des liaisons Cα-C, C-N ou N-Cα. Ce clivage va donner six types de fragments désignés respectivement par an, bn et cn si la charge positive est portée par l’extrémité N-terminal et respectivement xn, yn, et zn si la charge est portée par l’extrémité C-terminal. La nomenclature des fragmentations peptidiques est représentée Figure 15.
Figure 14. Schéma d’un spectromètre de masse triple quadripôle.
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Les fragments dn, wn et zn sont observés dans le cas de fragmentations à hautes énergies. La majorité des fragments obtenus sont de type yn et bn. Dans le cas de l’identification de l’adduit OPNA-FGESAGAAS, il a été montré qu’au contact du gaz de collision, le nonapeptide se rompt au niveau des liaisons amides et des chaines latérales du squelette peptidique, ce qui produit les fragmentations présentées Figure 16.
L’identification de l’OP fixé à la BuChE est effectuée en se basant sur la variation de masse du nonapeptide. Quand le composé organophosphoré se fixe sur le nonapeptide de m/z = 795.3, la masse du nonapeptide est modifiée par celle du composé OP. La masse théorique de l’adduit OP-nonapeptide est ainsi recherchée par spectrométrie de masse puis le
Figure 16. Schéma de fragmentation du nonapeptide FGESAGAAS au niveau des liaisons amides (sans OP). Le nombre en indice de b correspond au nombre d’acide aminés contenus dans le
fragment.
Figure 15. Nomenclature des fragments peptidiques. Issu de [1].
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pic correspondant est fragmenté en mode MRM, ce qui permet de détecter les transitions entre la masse théorique de l’adduit et les fragments caractéristiques après perte de l’OPNA (m/z 778, m/z 673, m/z 602…). Les masses correspondantes aux adduits formés entre le nonapeptide et quatre OPNA intacts et vieillis (sarin, soman, VX et tabun) sont répertoriées dans le Tableau 4.