Couplage en ligne des supports de protéines immobilisés au système chromatographique

3.1. Couplage de l’IMER au système chromatographique

Une des tendances actuelles dans le domaine de l’analyse consiste à intégrer les différentes étapes de l’analyse (extraction, digestion, séparation et détection) en un seul dispositif automatisable pour réduire les temps de traitement et d’analyse. Concernant la BuChE, un montage réalisé par Carol-Visser et al. [57] utilisant un IMER de pepsine commercial (Poroszyme^® 30 x 2.1 mm d.i.) couplé à la LC-MS² a été développé pour la digestion et l’analyse en ligne de la protéine (Figure 23).

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Dans ce montage, 10 µL de BuChE humaine (350 nmol.L^-1) intoxiquée par une solution de sarin à 1 µg.mL^-1 ont été injectés dans la précolonne de pepsine Poroszyme^® et digérés pendant 5 min avant d’être transférés sur la colonne analytique par une phase mobile 100% A (H2O, 0,2% HCOOH). Les peptides ont ensuite été séparés dans la colonne analytique (Pepmap C18, 150 x 1 mm) par un gradient eau/acétonitrile (070% B en 60 min) tandis que la précolonne a été régénérée par 100% de A. L’efficacité de la digestion a juste été déterminée en comparant les intensités de plusieurs pics (spécifiques de la BuChE) issus de la digestion par l’IMER aux intensités des mêmes pics pour la digestion en solution. Aucune information n’a été donnée concernant les conditions de digestions (pH, ratio Enzyme/Substrat, quantité de BuChE digérée…). Dans cette étude, l’aire du peptide a montré une bonne répétabilité avec un coefficient de variation de 10 % tandis que l’air du pic obtenu pour la digestion sur Poroszyme^® de pepsine correspond à 70 % de celle obtenue après la digestion en solution. Cependant, la quantification de cette méthode de digestion n’est que relative puisqu’aucune information n’a été fournie concernant les valeurs des taux de digestion de la BuChE sur colonne Poroszyme^®, ou encore sur les taux de greffage du réacteur. Les colonnes commerciales ont par ailleurs un cout élevé, d’autant plus que leur durée de vie est limitée à quelques dizaines de digestions [1]. Il parait donc préférable de Figure 23 : Représentation schématique du système analytique de digestion pepsique en ligne couplé à la LC-MS/MS (ESI/QTOF). A gauche, injection de l’échantillon vers l’IMER et la colonne. A droite,

séparation des peptides sur la colonne et régénération de la cartouche. Issu de [57].

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contrôler la synthèse des IMER plutôt que d’utiliser des IMER commerciaux afin de pouvoir choisir le support de greffage adéquat et d’optimiser la quantité d’enzymes immobilisées.

3.2. Couplage de l’immunoadsorbant au système chromatographique

L’intégration d’un immunoadsorbant à une technologie en ligne présente un grand intérêt par la sélectivité de l’extraction due à l’affinité antigène-anticorps. Il existe deux procédures différentes, dépendant du support utilisé pour l’immobilisation de l’anticorps.

L’utilisation d’un support résistant à la pression telle que la silice permet de connecter directement l’immunoadsorbant au système analytique. Cette approche a notamment été décrite pour l’immunoextraction de petites molécules ne nécessitant pas d’étape de digestion intermédiaire, les molécules piégées étant directement transférées vers la colonne analytique [65]. Pour les IS ne résistant pas à la pression mais stables sur une plus large gamme de pH, comme ceux issus d’un greffage sur sépharose, le montage doit être composé de deux précolonnes : la première contenant l’IS et la seconde composée de silice greffée C18 ou d’un copolymère apolaire. Dans ce cas, l’échantillon est percolé à faible débit à travers la première précolonne contenant l’IS puis après lavage, les deux colonnes sont couplées en série et les analytes sont désorbés par une solution aqueuse et reconcentrés sur la précolonne de piégeage.

De faibles débits sont utilisés sur cette précolonne de faible dimension, ce qui permet de ne générer qu’une faible perte de charge sur la précolonne contenant l’IS. Dans une seconde étape, l’IS est déconnecté et la colonne de piégeage est couplée en ligne avec la colonne analytique ce qui permet de désorber les analytes et de les entrainer vers la colonne analytique et le détecteur. Pour les protéines, l’immunoextraction est suivie d’une étape de digestion en solution. Cependant, cette étape est longue et peut conduire à l’autodigestion de l’enzyme.

C’est pourquoi des réacteurs enzymatiques sont préférés pour l’étape de digestion, en plus de leur possibilité de couplage en ligne à l’IS et la LC-MS.

3.3. Couplage en ligne de l’immunoadsorbant et de l’IMER à la LC-MS

La majorité des réacteurs enzymatiques dédiés à l’analyse de protéines sont à base de trypsine. Cependant, il parait difficile de coupler de tels IMER à un IS puisque la trypsine clive les protéines à un pH basique tandis que l’élution des protéines d’un IS se fait en milieu acide. Une méthode alternative se fonde donc sur l’utilisation d’un IMER de pepsine, clivant les protéines en milieu acide. Dans ce type de montage, présenté Figure 24 [1], la principale

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difficulté provient de la bonne compatibilité des solvants entre les différentes étapes. En effet, l’élution de l’immunoadsorbant se déroule en conditions acides, il est donc primordial de s’assurer que l’enzyme greffée dans l’IMER est active à pH acide, mais surtout que le support de greffage résiste à de faibles pH. Ainsi, les IMER à base de silice sont à proscrire pour tout couplage éventuel avec un immunoadsorbant tandis que des supports à base de sépharose semblent plus adaptés. Néanmoins, la sépharose est peu résistante à la pression ; il est donc nécessaire d’intégrer au montage un support de refocalisation des peptides résistant à la pression avant le transfert des peptides vers la colonne analytique. Le potentiel d’une telle procédure en ligne a été validé au LSABM à travers l’extraction et la digestion de 85 pmol de cytochrome c du plasma sur ce montage, donnant une réponse similaire en LC-MS à celle obtenue par un échantillon purement aqueux [71].