Apport de la RMN via l’approche par fragment

L’approche par fragment constitue à simplifier le système pour analyser finement les structures et interactions de fragments peptidiques. Lors de l’étude des boucles extracellulaires deux stratégies sont généralement employées pour contraindre les fragments peptidiques. La première consiste à utiliser des micelles de détergent pour permettre un ancrage de la boucle et la deuxième à cycliser de manière covalente le peptide. Les micelles de DPC possèdent un temps de corrélation adapté à l’étude RMN, par ailleurs leurs têtes zwiterrioniques forment un modèle de membrane a priori adapté. De nombreux travaux ont donc été conduits dans ce milieu. La présence d’un milieu mimant la membrane n’est pas sans influence sur les ligands. L’hypothèse d’une pré association/structuration du ligand à la membrane puis dans un second temps d’une liaison au récepteur a été émise depuis plusieurs dizaines d’années (Schwyzer, 1980). La relaxation induite par les radicaux permet de distinguer les parties enfouies dans le milieu micellaire ou exposées au solvent (exemple de l’étude sur la β-cyclodextrine (Giragossian et al., 2004)). L’étude RMN par fragment en milieu micellaire conduit à établir des différences fines de structuration même entre récepteurs proches. C’est le cas par exemple des boucles EC3 des récepteurs CCK1 et CCK2 (résumé dans (Giragossian and Mierke, 2003)). L’exemple suivant illustre les intérêts structuraux ou biologiques de contraindre les peptides mimant les boucles de RCPGs. La boucle EC3 du récepteur de la gonadotropine (GNRH) est un élément du récepteur permettant la liaison de l’hormone. Bien que le peptide linéaire soit biologiquement actif, le peptide cyclisé présente une plus forte activité inhibitrice de l’activation du récepteur et possède une conformation plus stable sous forme de coude β (Petry et al., 2002). Récemment la production de fragment peptidique déjà contraint a été rapportée. Ces fragments sont produits dans une souche d’E.Coli favorisant la création de ponts disulfure et ont là aussi permis d’obtenir des résultats d’interaction concordant avec la littérature (Pham et al., 2007). L’interaction d’un ligand avec un domaine du récepteur provoque des variations de déplacements chimiques mettant en évidence une interaction. Le caractère saturable, réversible et spécifique vis à vis d’un ligand (par rapport à un peptide de même composition en acide aminés mais avec une séquence aléatoire) est une preuve supplémentaire de la validité du système. De cette manière l’étude de la liaison de la substance P sur la boucle EC3 du récepteur neurokinine-1 fut réalisée en micelles de DPC et permis de mettre en évidence les résidus

XVII-129 impliqués dans la liaison (Ulfers et al., 2002c). L’analyse des courbes de titration fournies par les variations de déplacement chimique donne accès au Kd de l’interaction. L’interaction entre la partie N-terminale du récepteur CCR3 et l’eotaxin fut déterminée à 76 µM (Ye et al., 2000). Dans les deux études citées précédemment aucun effet NOE intermoléculaire n’a pu être détecté. En revanche entre la boucle EC2 cyclisée du récepteur du tromboxane A2 et son ligand, 4 résidus sont impliqués dans la formation d’effets NOE intermoléculaires (So et al., 2003). La mutation des résidus correspondant sur le récepteur entier entraîne pour 3 des mutants une baisse ou une disparition de l’affinité pour le ligand. L’étude RMN permet de déterminer si une structuration particulière est induite lors de la liaison. C’est le cas par exemple du ligand iloprost en interaction avec la boucle EC2 cyclisée du récepteur prostacycline (Ruan et al., 2003). A l’inverse dans le cas de la deltorphine II en interaction avec la boucle EC3 du récepteur DOP, c’est une déstabilisation par rupture de liaison hydrogène qui est envisagée (Fadhil et al., 2004). Dans cette étude les auteurs relèvent des variations de structuration du fragment peptidique mimant un domaine du récepteur. Cette modification est une déstabilisation du caractère hélical de la partie N-Terminale de la boucle EC3 au profit d’un tour. L’approche par fragment permet de révéler des sites d’interactions non suspectées et permet ainsi de déterminer la contribution précise de chaque domaine. La partie message de la deltorphine II semble ainsi se lier à la boucle EC3. Ceci explique également pourquoi des ligands spécifiques du récepteur MOP (les endomorphines 1 et 2) possédant une partie message similaire se lient à la boucle EC3.

XVII. Exemple de l’investigation moléculaire des spécificités entre les

systèmes Nociceptine-NOP et Dynorphine-KOP au sein de la famille des récepteurs opioïdes

Le système Nociceptin-NOP a suscité de nombreuses études basées sur les relations structure activité. Ce système est proche des systèmes opioïdes MOP, DOP, KOP mais présente toutefois des différences permettant ainsi une comparaison intéressante. L’intérêt est de déterminer les bases moléculaires entraînant la spécificité d’interaction et l’activation d’un récepteur. Le dogme établi pour la liaison des peptides opioïdes est que la séquence N- terminale, appelée « message », serait destinée à activer le récepteur et qu’elle serait complétée par une partie « adresse » destinée à augmenter le potentiel et la sélectivité pour un récepteur donné (Chavkin and Goldstein, 1981).

90°

Figure XVII-1 : Les acides aminés déterminants du cœur hydrophobe du récepteur NOP (figure réalisée à partir du modèle de Christopher Topham) Les segments transmembranaires 5 et 6 sont en rubans pour pouvoir visualiser le cœur du récepteur. Les acides aminés délimitant la poche hydrophobe commune aux récepteurs opiacés sont annotés en bleu et les acides aminés dont la mutation permet d’élargir le panel de ligand du récepteur NOP en rouge.

Phe 220

Phe 224

Trp 276

Asp 130

Tyr 131

Thr 305

Ala 216

Val 279

Qln 280

Val 281

XVII-131