Nousn'avons présenté, jusqu'àprésent, queledéveloppementetlavalidationde stratégies d'é hantillonnage onformationnel sur des exemples onnus. L'utilité de ette suite d'algorithmes est de pouvoir aider à la ompréhension des mé anismes de repliement,mais égalementde fournir aux expérimentateurs un outil pour om-plémenterleurs données, souventpartiellesetparfoisimpré ises, qui on ernent des molé ules dont la stru ture n'est pas toujours onnue. C'est pourquoi l'Hamilto-nienmolé ulaire omportedes termes supplémentaires pouvant être utiliséslorsque ertaines données sont disponibles.Ces données peuvent être de plusieurstypes:
ladistan e entre deux atomesest estimée, oudu moinsbornéedans une four- hette (grâ enotammentà la RMN,voir Van de Ven, 1995),
l'angled'une torsionest onnu ouestimé.
On pourrait,de la mêmefaçon, pénaliserlaviolation de toute formede ontraintes expérimentales
33 .
Les ontraintes expérimentales de distan e en parti ulier sont intégrées par le biaisde termesharmoniquesquiontdon uneetsemblableàla oupuredeliaisons. Tout se passe dans la simulation, omme si il existait une liaison entre les deux atomesimpliqués,jusqu'à e que lafour hette de distan es pré isées soitrespe tée. Ce i tend àa élérer onsidérablementla onvergen e de l'algorithme.
Par ailleurs, les molé ules étudiées expérimentalement sont généralement d'un ordre de taille supérieure à e que nous pouvons traiter, 'est une des raisons pour lesquellesnous avons développé la possibilité de faireun é hantillonnagepartiel de lamolé ule.
Nous avons don her hé à aborder des as réels de molé ules in onnues ou partiellement onnues.Nousprésentons i iundébutd'étudededeux as:lepremier se rapporte à l'exploration des onformations d'un tournant entre deux feuillets
β
. Le deuxième on erne la prédi tion du positionnement des deux brins terminaux d'uneprotéine dont le reste de la stru ture est onnue.3.8.1 Tournant de PIN1
Le fa teur limitantdans le pro essus de repliement du domaine WW de la pro-téine humaine PIN1, est la formation de la bou le du premier tournant. Comme toute stru ture biologique, ette molé ulea subi la pressionde séle tionde milliers
33
dipo-degénérations,onestdon endroitdesedemanderpourquoil'évolutiondarwinienne n'apas séle tionné de meilleuresséquen es, plusrapides àseformer etplus stables. Jägeretal.(2006)ont onsidéré laquestion enmutantlaprotéinea n derempla er ette bou le par des séquen es onnues pour se replier de façon plus robuste (voir aussi Nguyen et al.,2005).
Les mutants obtenus sont ee tivement plus stables et plus rapides, mais ils perdent partiellement leur fon tion biologique puisqu'ils n'interagissent plus ave leurs partenaires habituels. Ainsi, la pression de séle tion a favorisé la fon tion au prixd'un temps de repliement plus long.
Nous avons voulu mettre ela en éviden e en étudiant la bou le du premier tournantde laPIN1 sauvage et de ses mutants.
Pour ela, nous avons réalisé un é hantillonnage partiel (voir se tion 3.5.1.2) du domaine WW sauvage, noté
S
, et des deuxième et septième mutants (les plus stables) proposés par Jäger et al., notésM2
etM7
. Dans les trois as, les degrés de liberté appartenant aux a ides aminés du tournant ont été é hantillonnés (voir tableau3.4et gure3.51).Molé ule
atomes impliqués (et nombre)
a ides aminés impliqués (et nombre)
nombre de degrésde liberté
S
164 à305 (142) 19 à27 (9) 39M2
232 à349 (118) 15 à23 (8) 35M7
142 à251 (110) 15 à23 (7) 32Tab. 3.4: ara téristiquesdel'é hantillonnagedePIN1sauvage(
S
)etdesmutants 2(M2
)et 7(M7
).Fig. 3.51: séquen es des domaines WW sauvage et mutants, en vert gurent les a idesaminésoptimisés.
Pouranalyserlesrésultats, haque onformationé hantillonnéeaétéreportéesur ungraphedonnantsonRMSD
34
àlagéométrie ristallineetson énergie( gures3.52 pour
M7
et3.53 pourS
).Ilest alors possible de tra erune énergielibreen fon tion du RMSD (en rouge sur les gures).Fig. 3.52:marron:ensembledes onformationsé hantillonnéesdelaPINmutante en fon tion duRMSD aunatif et des énergiesinternes. En rouge : énergie libre en fon tionduRMSD.
Remarque : les résultats ne sont pas présentés pour
M2
qui n'a pas onvergé vers lastru ture expérimentale.On observealors des pro ls énergétiques diérents, oùlemutant possède globa-lement un unique puits ne dépassant pas 1,9Å, tandis que la PIN sauvage possède deux puits bien distin ts, le deuxièmeétant autourde 2,1Å.
L'utilisation du ritère RMSD n'est peut-être pas pertinente dans e as, ar dansun rayonde 2Åilestpossibledetrouveruneassezgrandevariétédestru tures. Nousavons don extrait les stru tures de plus basses énergies a n de lesvisualiser ( gures3.54 pour
M7
et 3.55 pourS
).En vert, gurent les stru tures ristallines de
S
etM7
. En orange, nous avons indiqué les meilleures solutions retournées par l'algorithme; elles orrespondent à desgéométriesà1,53ÅpourM7
et1,30ÅpourS
.En n,lesstru tures violettessont lesgéométrieslesplusdiérentes dunatifdansunefenêtrede 1k al.mol−1
audessus de lameilleure énergie(1,92Å pour
M7
et 2,06Å pourS
).Fig.3.54: mutantdelaPIN.Vert:stru ture ristallographique;orange:meilleure stru ture dé ouverte par l'algorithme (de meilleure énergie que le natif); violet : autre minimum à1,9Å.Les diéren ess'expliquent surtoutpardes réarrangements des haîneslatérales.
Fig. 3.55: PIN native. Vert : onformation native; orange : meilleure stru ture dé ouverteparl'algorithme(demeilleureénergiequelenatif);violet:géométrietrès diérente etd'énergie omparableauxautresminimaà2,1Ådunatif.
3.8.2 La y lophilline
La y lophilline B se lie à l'héparine. Pour étudier ette intera tion et, en parti ulier, mettre en éviden e le site de xation, des études par RMN ont été menées.Lastru turede la y lophillineB aété déterminéepardira tionderayons X(JinetHarrison,2002), ependant,lorsdelapuri ation,lesdeuxbrinsterminaux ontété oupés par protéolyse. Or, lesrésultats de RMN prédisent justement que le sitede xationimplique es brins terminaux.Il est don né essaire de déterminerle positionnement de es brins.
Nous avons alors proposé de modéliser ette partie de la y lophilline, en gar-dant le reste de la protéine (dont la stru ture est onnue) xe. L'hypothèse est que les impré isions du hamp de for es sur une molé ulesi grande seront ompensées par les quelques ontraintes expérimentales disponibles. Lesétudes par RMN de la y lophilline B ave héparine ont en eet permis de restreindre des distan es in-teratomiques impliquant ertains atomes de es brins (total de 19 ontraintes de distan es exploitables).
LesbrinsN-ter etC-terontétére onstruitsmanuellementenutilisantl'interfa e de on eption de PyMol
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, dans une onformation quel onque. Nous avons alors autorisé116degrésde libertéàêtreoptimisés,impliquantplus de400 atomesparmi près de 3000 (voir gure 3.56). Ces degrés de liberté on ernent prin ipalement les
brins terminaux, mais également quelques haînes latérales du reste de la protéine sus eptiblesd'interagir (partiessur fondrouge dans la gure).
Fig. 3.56: stru turede la y lophillineB, lesbrins terminauxontété positionnés manuellement.Lesatomessurfondrouge orrespondentauxpartiesquenous avons optimisées.
Malgré le nombre important de degrés de liberté, l'algorithme arrive à lo aliser des solutions de basses énergies dans le sous-domaine respe tant les ontraintes expérimentales. L'intérêt de l'utilisation de notre algorithme, est qu'il est onçu pourrenvoyerun ensemblede solutions,permettantde ara tériser la exibilitédes brinsdanslalimitedes ontraintesexpérimentales.La gure3.57montrelameilleure solutiontrouvée.
Cette étude a ainsi permis de valider le prin ipe d'intégration de onnaissan es expérimentales par le biais de ontraintes énergétiques. Elle s'insère dans le adre d'uneétudeplus omplètesur l'intera tion de l'héparineave la y lophillineetfait l'objet d'un arti le ré emment a epté dans le Journal of Biologi alChemistry (Hanoulleet al., àparaître).