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2.1 Introduction
La friture est un mode de cuisson très apprécié en Amérique du Nord. Toutefois, les huiles utilisées pour ce genre de cuisson contiennent très souvent une grande quantité d’AG insaturés. Ainsi, lors d’une utilisation prolongée de l’huile de friture, diverses réactions de dégradation se produisent. Parmi celles-ci, l’oxydation des AG en produits plus polaires, tels que des peroxydes, des alcools et des aldéhydes, est la réaction de dégradation la plus importante (Dana et Saguy, 2001, Frankel, 1984, Marquez-Ruiz et Dobarganes, 2007). Les composés qui sont alors créés sont reconnus comme étant nocifs pour la santé. D’autres produits, tous aussi nocifs, peuvent également être formés. Parmi ceux-ci, on retrouve les AG trans et conjugués, ainsi que les MCAG (Orthoefer et List, 2007b).
Divers facteurs peuvent influencer l’oxydation des AG dans les huiles de friture. Certains peuvent augmenter l’oxydation, comme la température et la concentration en oxygène et en prooxydants, alors que d’autres, comme les antioxydants, vont la diminuer (McClements et Decker, 2007). Deux sortes d’antioxydants existent, soit les primaires et les secondaires (Gutteridge, 1994, Wanasundara et Shahidi, 2005). Les premiers sont principalement des molécules qui contiennent un groupement phénolique. Leur mode d’action consiste à inhiber l’initiation du mécanisme d’oxydation ou la propagation des radicaux libres formés lors du mécanisme d’oxydation. Pour ce qui est des antioxydants secondaires, ils consistent en des molécules capables de capter l’oxygène présent dans les huiles. Ceux-ci sont généralement constitués de molécules ayant un système de liaisons π conjuguées.
Les antioxydants primaires sont les plus utilisés dans les huiles alimentaires. Les plus populaires sont des antioxydants synthétiques, tels que le BHT, le BHA et le TBHQ (Madhavi, et al., 1996, McClements et Decker, 2007). Certaines études ont toutefois démontré que ces produits pouvaient avoir un effet nocif sur la santé (Shahidi et Zhong, 2005). Pour cette raison, leur utilisation est régie par la loi dans la plupart des pays, dont le
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Canada (Santé Canada, 2013). Malgré cela, et dû à un mouvement santé chez les consommateurs, des antioxydants d’origine naturels sont recherchés afin de les remplacer.
Les composés naturels qui sont généralement utilisés sont des polyphénols, tel que le α-tocophérol (Madhavi, et al., 1996). Plusieurs ont déjà démontré un effet antioxydant significatif, toutefois, dû à leur groupement polaire, ces produits sont très peu solubles dans les lipides (Choe et Min, 2009, Shahidi et Zhong, 2010). Ainsi, l’ajout d’une chaîne hydrophobe à ces molécules en augmenterait la solubilité dans les lipides et ainsi permettraient leurs usages dans les huiles de friture. Cet ajout pourrait également en diminuer la volatilité et ainsi leur donner une plus grande stabilité à des températures élevées, tels que celles utilisées en friture. Ce projet visait donc à développer des antioxydants dérivant de produits naturels afin de pouvoir les utiliser en milieu de friture.
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2.2 Hypothèse et objectifs spécifiques
Hypothèse
L’ajout d’une chaîne lipophile sur certains acides phénoliques permettra d’en augmenter la solubilité dans les lipides, tout en diminuant leur volatilité. Cela permettra donc de tirer profit de leur propriété antioxydante en friture.
Objectifs
Synthétiser et purifier des esters d’alcools gras d’acides phénoliques pour utiliser comme antioxydants dans les huiles de friture.
Tester l’efficacité de ces molécules par des traitements thermo-oxydatifs dans l’huile de Canola.
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2.3 Méthodologie
2.3.1 Synthèse du vanillate d’hexyle
La méthode que nous avons utilisée afin d’estérifier les acides organiques consiste à transformer les fonctions acides en sel de potassium pour ensuite les estérifier avec un iodure d’alcane (Figure 2.1). Le protocole qui a été choisi (Pfeffer et Silbert, 1976) consistait tout d’abord à faire un titrage de l’acide vanillique (2.1) avec une solution de KOH afin de former le sel d’acide correspondant (2.2). Après l’isolation du sel, celui-ci était ensuite mis en solution avec un iodure d’alcane, soit le 1-iodo-hexane, afin de former l’ester final (2.3). Le vanillate d’hexyle est ainsi obtenu après une purification sur colonne chromatographique de gel de silice. Une solution de 10% AcOEt / 90% hexane a été utilisée comme éluant.
MeO HO O OH KOH MeO HO O O-K+ EtOH I-hexane DMSO 85°C, 20h MeO HO O O 2.1 2.2 2.3
Figure 2.1 : Schéma de synthèse du vanillate d’hexyle.
Les conditions utilisées pour cette réaction ont été déterminée selon une étude cinétique trouvée dans la littérature (Pfeffer et Silbert, 1976). Selon cette étude, le choix du cation utilisé pour faire le sel, le solvant, ainsi que l’halogénure utilisé pour effectuer la réaction ont un impact sur la vitesse de formation de l’ester final. Ainsi, le KOH a été utilisé de préférence au NaOH afin de faire le sel d’acide. Un iodure a également été choisi de préférence à un bromure, car il permettait d’obtenir le produit de l’estérification 17 fois plus rapidement. Le DMSO a toutefois été choisi de préférence au HMPA, malgré son plus faible rendement, pour des raisons de disponibilité et de toxicité.
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2.3.2 Synthèse du vanillate de dodécyle
La synthèse du vanillate de dodécyle a d’abord été faite en suivant le même protocole que pour le vanillate d’hexyle, mais après quelques essais, l’ester voulu (2.4) n’était toujours pas formé. D’autres conditions réactionnelles ont été retenues. Elles consistent à former le sel de l’acide, sans l’isoler, et à apposer la chaîne alkyle dans la même étape (Moore, et al., 1979).
I-dodécane K2CO3, acétone , 16h MeO HO O OH MeO HO O O 2.1 2.4
Figure 2.2 : Synthèse du vanillate de dodécyle.
L’acide vanillique (2.1) a été mis en solution dans l’acétone, puis du carbonate de potassium a été ajouté. Après quelques minutes d’agitation, le 1-iodo-dodécane était ajouté. La réaction a ensuite été maintenue à reflux pendant une nuit entière et l’ester (2.4) a été obtenu après une purification sur colonne chromatographique de gel de silice en utilisant une solution de 10% AcoEt / 90% hexane comme solvant d’élution.
2.3.3 Synthèse du coumarate d’hexyle
La synthèse du coumarate d’hexyle a été réalisée selon le même protocole que pour le vanillate de dodécyle. Des ajustements ont toutefois dû être apportés, entre autre par rapport au temps de réaction. Ainsi, l’acide p-coumarique (2.5) a été mis en solution dans l’acétone avec le carbonate de potassium, puis le 1-iodo-hexane a été ajouté et le mélange réactionnel a été maintenu à reflux pendant plusieurs nuits. L’ester (2.6) a été obtenu après une purification sur colonne chromatographique de gel de silice en utilisant un gradient de solvant pour l’élution : 35% AcOEt / 65% hexane, suivi de 50% AcOEt / 50% hexane, puis de 65% AcOEt / 35% hexane.
36 HO O OH HO O O I-hexane K2CO3, acétone , 16h 2.5 2.6
Figure 2.3 : Synthèse du coumarate d’hexyle. 2.3.4 Analyse thermique différentielle
La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une technique que nous avons utilisée afin de déterminer le comportement des différents composés utilisés comme antioxydants sous l’effet de la chaleur. Cela pouvait donc nous permettre de déterminer la température de fusion et la température de dégradation des produits. Un appareil DSC Q1000 de TA Instrument à été utilisé. Le programme de température à consister en une augmentation de températures de 10°C/min de 40°C à 200°C.
2.3.5 Test d’efficacité des antioxydants dans l’huile de Canola
Afin de vérifier l’effet antioxydants des différentes molécules, et préalablement aux tests en condition de friture, des traitements thermo-oxydatif ont d’abord été fait dans l’huile de Canola. Les antioxydants étaient alors dissouts dans l’huile de Canola à 1,0% m/m. Des échantillons de 0,5g sont préparés dans des vials 2Dr. La moitié ne contient que de l’huile de Canola et l’autre moitié contient l’huile supplémentée avec le composé testé. Tous les échantillons sont alors mis dans un four à 120°C pour une période de 4h, 1 jour et 2 jours. Les vials étaient ouverts afin de permettre un contact avec l’air ambiant. Lorsque les échantillons étaient sortis du four, ils étaient conservés sous atmosphère d’azote et à -20°C jusqu’à ce qu’ils soient analysés. Lorsque ce test était concluant, c’est-à-dire lorsque le composé montrait un effet antioxydant, d’autres tests étaient réalisés en diminuant la concentration des antioxydants dans l’huile de Canola à 0,5%, puis à 0,1%. Si ces tests étaient concluants, d’autres tests étaient faits en augmentant la température à 135°C, 150°C, 165°C, puis à 180°C. Des échantillons d’huile de Canola contenant du BHT aux mêmes concentrations que le composé testé étaient également soumis aux différents tests. Ces
37 échantillons servaient de témoin positif et permettaient ainsi de comparer les résultats obtenus avec un produit déjà reconnus comme un bon antioxydant.
Si un composé démontrait une efficacité antioxydante comparable à celle du BHT à une température de 180°C et à une concentration de 0,1%, il était ensuite testé en milieu de friture.
2.3.6 Test d’efficacité des antioxydants en condition de friture
Afin d’effectuer les tests en condition de friture, une friteuse de 2L (Hamilton Beach) a été utilisée. Les frites et l’huile avaient un ratio 1:6 (m/v) tel qu’il a été recommandé par Morton et Childley (1988), soit 1,2L d’huile pour 200g de frites. Les analyses en milieu de friture ont été faites trois fois avec de l’huile de Canola, trois fois avec de l’huile de Canola contenant 0,1% de BHT et une fois avec de l’huile de Canola contenant 0,1% de notre antioxydant. Un seul test a été effectué avec le coumarate d’hexyle, car nous ne disposions pas d’une quantité suffisante de produit pour effectuer plusieurs tests. Les tests effectués avec le BHT servaient de contrôle positif. Les résultats obtenus avec notre antioxydant ont été comparés à ceux obtenus avec le BHT et à l’huile de Canola seule.
L’huile de la friteuse était tout d’abord chauffée pendant environ 30min. afin d’obtenir une température d’environ 180°C. Les frites étaient alors plongées dans l’huile pour une période de 10min. Une période d’attende de 20min. était effectué entre chaque lot de frites afin de laisser l’huile reprendre sa température initiale. Quinze périodes de friture ont été effectuées sur une période d’environ 8h. Un échantillon d’huile était prélevé avant et après chaque lot de frites. Les huiles étaient ensuite gardées sous atmosphère d’azote à une température de -20°C jusqu’à leur analyse. Tout au long des expériences de friture, la température était mesurée à l’aide d’un thermomètre électronique. De plus, le niveau de l’huile était constamment surveillé afin de maintenir le bon ratio de frites/huile (Morton et Chidley, 1988).
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2.3.7 Analyse des huiles
Différentes méthodes d’analyses peuvent être utilisées pour l’analyse du niveau d’oxydation de l’huile de friture. La détermination des composés polaires, des AG oxydés, des AG conjugués et la composition en AG de l’huile usée sont les méthodes standards les plus utilisées. La mesure des peroxydes et le test de p-anisidine peuvent également être réalisés (Orthoefer et List, 2007b). Toutefois, comme les peroxydes ont un temps de demi- vie d’une heure à 150°C (Pryor, 1966) cette mesure ne parait donc pas appropriée pour des huiles chauffées à 180°C pendant plusieurs heures. C’est donc pour cette raison que nous avons choisi d’analyser la composition en acide gras résiduels des huiles de friture. Ainsi, au lieu de mesurer ce qui c’est oxydé, nous analysons ce qui ne s’est pas dégrader.
L’analyse de l’efficacité se faisait en analysant la composition finale des huiles sous leurs formes d’esters méthylés (FAME). Les cinq principaux acides qui ont été observés sont l’acide palmitique (C16:0), l’acide stéarique (C18:0), l’acide oléique (C18:1), l’acide linoléique (C18:2) et l’acide linolénique (C18:3). Les AG contenant le plus d’insaturations seront ceux qui s’oxyderont le plus. L’acide palmitique, ne contenant pas d’insaturations ne se détériorent pratiquement pas. Pour cette raison, il a été utilisé comme standard interne lors du traitement des données. Ainsi, lors de l’analyse, en comparant les différentes teneurs d’AG résiduels, s’il restait plus d’AG insaturés dans une huile contenant un antioxydant, cela signifiait que le produit utilisé était efficace. Au contraire, si la teneur en AG insaturés était plus faible dans une huile contenant un antioxydant que dans le contrôle, cela signifiait que la substance utilisée agissait en fait comme un prooxydant.
La séparation par GC a été réalisée avec une colonne BPX-70 (60m x 0,25mm x 0,25 µm, dont le film intérieur de la phase stationnaire est composé de 70% Cyanopropyle – 30% Polydiméthylsiloxane co polymère). Les échantillons ont été injectés en mode split (ratio 1 : 50) et la température de l’injecteur a été fixée à 250°C. L’hydrogène (H2) a été
utilisé comme gaz vecteur avec un flux constant de 1,29mL/min et vitesse linéaire constante de 32cm/sec. Pour la séparation par GC, un programme de gradient de
39 température a été utilisé (Tableau 2.1). Les FAME ont été identifiés en comparant leur temps de rétention avec ceux de standards commerciaux.
Tableau 2.1 : Programme de température utilisé en GC pour la séparation des FAME.
Température initiale (°C) Gradient (°C/min) Température finale (°C) Maintien de la température finale (minutes) 60 0 60 1 60 10 190 15 190 5 200 14
2.4 Résultats et Discussion
2.4.1 Synthèse du vanillate d’hexyle
La synthèse du vanillate d’hexyle s’est faite en deux étapes (Pfeffer et Silbert, 1976). Tout d’abord, il y a eu la formation d’un sel de l’acide vanillique (2.2). Le sel a été formé par titration de l’acide vanillique avec le KOH. La phénolphtaléine était utilisée comme indicateur. Le sel est ensuite alkylé en utilisant un iodure d’alcane pour produire l’ester final (2.3).
Le solide obtenu était une poudre ayant une teinte rosée dû à la phénolphtaléine. Un rendement supérieur à 100% a souvent été obtenu, mais celui-ci peut s’expliquer par le surplus de KOH présent dans le produit. La base était toutefois éliminée lors des lavages du produit final avec de l’eau. Pour ce qui est de la couleur rosée du produit, elle provient de la phénolphtaléine. Celle-ci était éliminée par un lavage du produit final avec une solution de Na2S2O3. Un rendement après lavage et purification de 15% a été obtenu.
La présence de l’ester a été confirmée par le spectre MS (Annexe, Figure A.1). L’ion moléculaire à m/z = 255 est bien présent. De plus, il est possible de voir le fragment majoritaire à m/z = 168 (2.8). Ce fragment provient d’un réarrangement de McLafferty (Figure 2.4). Les fragments à m/z = 123 et 151 proviennent du clivage des liaisons voisines du lien C=O.
40 O O H CH (CH2)3 O O MeO HO MeO HO H m/z = 168 2.7 2.8 m/z = 255
Figure 2.4 : Réarrangement de McLafferty du vanillate d’hexyle.
Le spectre IR (Annexe, Figure A.2) permet également de confirmer la transformation de l’acide en ester. En effet, la fréquence de vibration de l’élongation du lien C=O se trouve à 1707 cm-1 pour l’ester, alors qu’elle est à 1680 cm-1 pour l’acide vanillique
(Clavijo, et al., 2008). Les fréquences caractéristiques des acides et des esters se trouvant normalement près de 1706-1720 cm-1 et 1735-1750 cm-1 respectivement, les fréquences qui
sont observés ici peuvent être expliquer par la présence d’un groupement aryle à proximité qui induit une conjugaison des doubles liens (Silverstein, et al., 2007a). La bande caractéristique de la vibration d’élongation du lien C-O est visible à 1278 cm-1 pour l’ester.
La fréquence d’élongation du lien CC(=O)-O est également visible à 1215 cm-1. À 3397
cm-1, il est possible de voir la fréquence d’élongation du lien O-H (Silverstein, et al.,
2007a). Cela confirme donc que l’ester possède toujours sa fonction phénol. Cela permet donc de confirmer que l’ester a bien été obtenu.
2.4.2 Synthèse du vanillate de dodécyle
La synthèse du vanillate de dodécyle était tout d’abord faite selon le même protocole que le vanillate d’hexyle. Toutefois, dû à un encombrement stérique dû à la longueur de la chaîne alkyle, la réaction ne fonctionnait pas. Un protocole alternatif a donc dû être trouvé. Ce dernier permet de former l’ester en une seule étape. Il consistait à mettre en présence l’acide phénolique, le sel de potassium et l’iodure d’alcane (Moore, et al., 1979). Ce protocole permettait donc de diminuer le temps de réaction en éliminant une étape. Quelques ajustements ont dû être fait afin d’augmenter le rendement de la réaction et de faciliter la purification. Ainsi, puisque l’acide ne semblait réagir en entier, nous avons donc augmenté les équivalences du sel de potassium et de l’iodure de dodécane. De plus,
41 lors de l’arrêt de la réaction, un lavage supplémentaire avec une solution de Na2CO3 a été
fait afin d’éliminer l’acide vanillique restant. Suite à une purification à l’aide d’une colonne de chromatographie, un solide blanc était obtenu.
La présence de l’ester a pu être confirmée par le spectre MS (Annexe, Figure A.3). L’ion moléculaire m/z = 336 est bien présent. De plus, il est possible de voir le fragment à m/z = 168 (2.10) qui est dû au réarrangement de McLafferty (Figure 2.5). Les fragments à m/z = 123 et 151 proviennent du clivage des liaisons voisines du lien C=O.
O O H CH (CH2)9 O O MeO HO MeO HO H m/z = 168 2.9 2.10 m/z = 336
Figure 2.5 : Réarrangement de McLafferty du vanillate de dodécyle.
Le spectre IR (Annexe, Figure A.4) confirme bien également la transformation de la fonction acide en ester. En effet, il est possible de voir que la bande représentant la vibration d’élongation du lien C=O est à 1685 cm-1 pour l’ester, alors qu’elle est à 1680 cm- 1 pour l’acide vanillique (Clavijo, et al., 2008). La fréquence qui est observée est également
plus faible que celle du vanillate d’hexyle dû à une chaîne aliphatique plus longue. La fréquence de vibration de l’élongation du lien C-O est visible à 1281 cm-1. La fréquence
d’élongation du lien O-H est toujours visible à 3327 cm-1, confirmant que la fonction alcool
est toujours présente. Cela confirme donc que l’ester a bien été obtenu.
2.4.3 Synthèse du coumarate d’hexyle
La synthèse du coumarate d’hexyle a tout d’abord été optimisée. Le temps de réaction, l’utilisation d’un chauffage et le sel utilisé, soit le KHCO3 ou le K2CO3, ont donc
été modifiés à plusieurs reprises. Les meilleurs résultats ont donc été obtenus en utilisant le KHCO3 avec un chauffage à reflux pendant une semaine.
42
Nous avons également pu remarquer que lorsque la réaction était effectuée plus longtemps, il arrivait que deux chaînes alkyles soit ajoutées au lieu d’une seule (2.11). Puisque le pouvoir antioxydants de ces composés provient de leur fonction phénol, cette molécule nous était donc d’aucune utilité. Ce produit était également très dur à séparer par colonne chromatographique sur gel de silice.
O O O
2.11
Figure 2.6 : Produits secondaires de la réaction d’estérification de l’acide p-coumarique.
Le coumarate d’hexyle s’est également avéré difficile à purifier. De bonnes conditions ont été trouvées en colonne chromatographique sur gel de silice, mais très peu de produits étaient récupérés suite à la purification. Le moyen le plus utile qui fut trouvé fut d’évaporer l’essentiel de l’iodo-hexane restant dans le produit en laissant le produit final plus longtemps sur le rotavapeur à une température plus élevée. Une colonne était donc parfois nécessaire pour retirer l’iodo-hexane résiduel.
La présence de l’ester a été confirmé sur le spectre MS (Annexe, Figure A.5). L’ion moléculaire à m/z = 248 est bien présent. Il est également possible de voir le fragment à m/z = 164 (2.13) dû au réarrangement de McLafferty (Figure 2.7). Les fragments à m/z = 91 et 65 sont caractéristiques d’un cycle aromatique substitué par un alkyle. Les fragments à m/z = 119 et 147 proviennent du clivage des liaisons voisines du lien C=O.
HO O O (CH2)3 H HO O O H m/z = 164 2.13 2.12 m/z = 248
43 Le spectre IR (Annexe, Figure A.6) confirme bien également la transformation de la fonction acide en ester. En effet, il est possible de voir que la bande représentant la vibration d’élongation du lien C=O est à 1670 cm-1, alors qu’elle est aux environs de 1667
cm-1 pour l’acide p-coumarique. La valeur habituelle pour un ester est de 1735 cm-1 et celle
de l’acide est de 1710 cm-1 (Silverstein, et al., 2007a), mais les faibles valeurs obtenues
peuvent être expliqué par la proximité d’une double liaison suivie d’un cycle aromatique. Cela permet donc la résonance des électrons (Figure 2.8). Ainsi, la résonance affaibli le lien carbonyle, ce qui diminue sa fréquence d’absorption (Silverstein, et al., 2007a).
HO O OH HO O OH
Figure 2.8 : Structure de résonance de l’acide p-coumarique.
De plus, la fréquence de vibration de l’élongation du lien C-O se trouve à 1273 cm- 1. Cela confirme donc que l’ester a bien été obtenu. Il est également possible de voir la
bande d’élongation du lien O-H à 3371 cm-1. Cela confirme donc que l’ester possède
toujours sa fonction phénol.
2.4.4 Analyse en DSC
Les résultats obtenus en DSC (Figure 2.9) montrent que, pour les trois composés, aucun changement n’est visible entre 50 et 200°C. Puisque ces composés n’ont été utilisés qu’à une température de 120°C, on est donc certain qu’aucune dégradation du composé ne s’est produite lors des traitements thermo-oxydatifs, et donc qu’ils étaient bien présents dans l’huile tout au long de l’expérience.
44
Figure 2.9 : Comparaison des résultats du vanillate d’hexyle et de dodécyle et du
coumarate d’hexyle au DSC pour des températures de 50°C à 200°C.