Analyses protéiques

2.4.1 Extraction protéique

Les cellules confluentes à 80% sont détachées par grattage puis centrifugées à 500g

pendant 5min. Le surnageant est éliminé et chaque culot cellulaire est re-suspendu dans 150µl

de tampon de lyse RIPA (Thermo Scientific, Villebon sur Yvette, France) contenant une

tablette de cOmplete® Protease inhibitor (Roche, Mannheim, Allemagne) pour 10ml de

tampon RIPA. Les échantillons sont gardés sur glace pendant 1h avec une agitation par vortex

toutes les 10min. Une centrifugation à 12000g pendant 45min à 4°C est effectuée afin

d’éliminer les précipités. Le surnageant est récupéré pour analyse.

2.4.2 Mesure de la concentration en protéine

La méthode BCA, BiCinchoninic acid Assay, (Smith et al. 1985) est un test

colorimétrique permettant de doser la quantité de protéines présente dans un échantillon

relativement à une gamme d’étalonnage de quantité connue de BSA (Albumine de Sérum

Bovin). Le principe de la méthode repose sur la réduction en milieu alcalin des ions

cuivriques Cu2+ en Cu+ par les protéines. L’acide bicinchoninique (BCA) est un réactif spécifique du Cu+ qui forme une coloration pourpre ayant une absorbance maximale à 562nm et dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de protéine présente dans l’échantillon. La

concentration en protéine des échantillons est calculée grâce à une courbe de référence allant

de 0 à 2µg/ml de BSA.

Les échantillons à mesurer sont préparés à deux dilutions de 1/10 et 1/20 dans de l’eau

ultrapure. La gamme d’étalonnage est obtenue à partir d’un kit BCA (Interchim, Montlucon,

119

bicinchoninique) à 50 parts de réactif A (solution de soude à 0,1N). Dans une plaque 96 puits,

25µl de standards et d’échantillons sont déposés en triplicats. 200µl de BCA sont ajoutés dans

chaque puits, la plaque est incubée 30 min à 37°C et l’absorbance à 562nm est mesurée au

spectrophotomètre (Thermo Scientific, Villebon sur Yvette, France). La gamme d’étalonnage

est construite à partir des standards et permet de calculer les concentrations de chacun de nos

échantillons inconnus.

2.4.3 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de

dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE)

Le SDS-PAGE est une technique permettant la migration des protéines à travers un gel

de polyacrylamide afin de les séparer en fonction de leur taille. Le principe de cette technique

est basé sur la dénaturation de la conformation protéique et l’ajout de charge négative due à la

présence de SDS (sodium dodécyl sulfate), un agent dénaturant possédant une extrémité

chargée négativement. Ainsi, les protéines déposées sur le gel vont pouvoir migrer par

l’application d’un courant électrique allant de la cathode vers l’anode.

Les protéines (45µg) sont déposées dans des gels 4-20% (TGX SDS pre-casted

polyacrylamide gels, BioRad, Hercules, USA). Les protéines sont diluées dans un tampon

Laemmli (BioRad, Hercules, USA) contenant du β-mercaptoéthanol comme agent réducteur

permettant de couper les ponts disulfures responsables du repliement des protéines. Avant

l’électrophorèse, les échantillons sont chauffés à 95°C pendant 5min. Un marqueur de poids

moléculaire est déposé des deux côtés du gel afin de confirmer la taille des protéines révélées

par la suite (Precision Plus Protein Dual color standard, BioRad, Hercules, Etats-Unis). La

migration électrophorétique est réalisée grâce à un courant de 180mV et un tampon de

120

2.4.4 Western blot

La partie Western blot réfère à la migration des protéines sur une membrane

permettant leur révélation et quantification à l’aide de technique d’immunomarquage. Pour

cela les protéines qui ont migré à travers le gel de polyacrylamide grâce à la technique de SDS

PAGE vont devoir être transférées sur un support plus adapté permettant de révéler les

protéines d’intérêt à l’aide d’anticorps spécifiques. Ce support est une membrane de

polyfluorure de vinylidène (PVDF) qui possède une haute affinité de liaison avec les protéines

assurant ainsi une qualité de transfert optimale.

2.4.4.1 Transfert semi-sec

Afin de procéder au transfert des protéines contenues dans le gel de polyacrylamide

sur la membrane de PVDF, la technique de transfert « semi-sec » est adoptée. Pour cela, deux

piles de papier filtre sont enduites de tampon de transfert. La membrane de PVDF est activée

pendant 5min dans l’éthanol absolu avant réalisation du transfert. Ensuite, la membrane et le

gel contenant les protéines sont placés en « sandwich » entre les piles de papier filtre qui sont

déposées en contact direct avec les deux électrodes de la cassette de transfert. La membrane

de PVDF est placée le plus proche de l’anode et le gel du côté de la cathode. La cassette est

ensuite insérée dans le système de transfert Transblot Turbo system (BioRad, Hercules, Etats-

Unis) et l’intensité du courant appliqué est réglé en fonction du poids moléculaire de la

121

Tableau 5 : Protocole de transfert des protéines du gel vers la membrane de PVDF en fonction du poids moléculaire de la protéine.

2.4.4.2 Système de quantification « stain free » et immuno-detection

Afin de procéder à l’immuno-détection des protéines d’intérêt la membrane est

incubée pendant 1h à température ambiante dans une solution de bloquant afin de saturer les

sites aspécifiques. La membrane est incubée toute la nuit à 4°C dans l’anticorps primaire

(dirigé contre la protéine d’intérêt) dilué dans la solution de bloquant.

Le lendemain, la membrane est lavée trois fois 5 min dans une solution de lavage

TBS-Tween 0,1% (TBS-T) puis incubée 1h à température ambiante dans l’anticorps

secondaire conjugué à la peroxydase, également dilué dans la solution de bloquant. Après 3

nouveaux lavages de 5min dans du TBS-T, la protéine d’intérêt est révélée grâce à l’ajout du

substrat de révélation chemiluminescent (Clarity Western electrochemoluminescence

substrate, BioRad, Hercules, Etats-Unis). Le substrat en présence de l’enzyme produira une

réaction luminescente qui sera quantifiée par le détecteur ChemiDoc MP (Biorad, Hercules,

CA, USA).

Poids moléculaire (kDa)

Temps (min) Courant

>150 10

2.5A constant, jusqu’à 25V

<30 5

122

La méthode de normalisation classique du Western Blot consiste à révéler une protéine de

référence en parallèle de la protéine d’intérêt par la même méthode d’immuno-détection. La

protéine de référence sert de contrôle interne à l’expérience et permet de s’assurer (i) que la

même quantité de protéine a été déposée dans chaque puits ; (ii) que le transfert a été effectué

avec la même efficacité pour tous les échantillons et enfin (iii) que l’incubation avec les

anticorps a été répartie de façon homogène sur toute la membrane. Pour être un bon contrôle

interne, la protéine de référence doit répondre à différents critères et ne doit notamment pas

être influencée par les différentes conditions d’expérimentation. Une méthode alternative est

la technique de quantification par protéines totales grâce à la méthode d’imagerie « stain-

free ». L’imagerie stain-free utilise le gel de polyacrylamide pour exacerber la fluorescence

des acides aminés tryptophanes présents dans les protéines grâce à une brève photoactivation. Ceci permet de visualiser directement l’ensemble des protéines présentes à chaque étape de l’électrophorèse et du western blot. Cette technique permet de normaliser directement le signal de la protéine d’intérêt sur la quantité de protéines totales contenue dans l’échantillon, donnant lieu à une quantification plus précise et plus sensible qui s’affranchit des variations des techniques immunochimiques (Gurtler et al. 2013).

L’intensité des bandes et la quantification du ratio protéine d’intérêt/protéines totales

123

Tableau 6 : Liste des anticorps utilisés dans les analyses Western blot.