Analyses préliminaires

3.3.2.1 Choix du solvant

La problématique abordée ici étant la même entre les 12 formulations, nous étudierons en détail le cas de la formulation 3 Super Bold, nous permettant d’expliciter tous les problèmes surmontés et nous mettrons les résultats en perspectives avec les 11 autres formulations étudiées.

Au vu des données à notre disposition et de la prédominante quantité d’huile annoncé par rapport aux actifs (ratio environ 8 :1 en poids) une première analyse a été menée dans du chloroforme. Ces conditions expérimentales sont en accord avec celles publiés dernièrement par Ribeiro et son équipe, car elles permettent de solubiliser à la fois les excipients et les actifs annoncés.32 _{Ces travaux n’étaient}

pas publiés au moment de la réalisation des travaux et de la mise au point des conditions expérimentales. Comme montré en Figure 27A, l’abondante présence d’huile, et notamment les signaux correspondant à l’enchainement de groupement CH2 aliphatiques ainsi que les méthyles

terminaux, rendent cependant extrêmement complexe l’attribution ainsi que la détection des différences entre ces esters de stéroïdes (en rouge sur la Figure 27) qui, dans leur majorité, du fait de leurs structures semblables ne sont discernables uniquement que grâce aux signaux de la région aliphatique. Deux problèmes intrinsèques s’ajoutent à ce problème, la solubilisation d’une grande quantité d’huile rend le milieu analysé extrêmement visqueux et de fait diminue la dynamique moléculaire donnant un rôle primordial à la relaxation transversale (T2*). La zone aliphatique de ces

substances présentant toutes un cœur stérane semblable en devient donc quasi inexploitable. Le second problème est plus un problème intrinsèque à la RMN, l’abondante présence des signaux d’acides gras rend également difficile un réglage approprié de l’atténuation du récepteur, rendant les

113 signaux des produits actifs plus mal digitalisés que ceux des acides gras. Bien que ces difficultés ne soient pas discutées dans leur publication par Ribeiro et son équipe, nous pouvons constater au travers des exemples montrés qu'ils obtiennent également des spectres mal résolus, pour lesquels une attribution univoque uniquement par RMN semble complexe.32-33

Pour toutes ces raisons, nous avons décidé de changer de solvant et d’utiliser un solvant plus polaire, permettant une solubilité intéressante des actifs annoncés, mais une solubilité plus faible voire négligeable des acides gras. De fait, nous avons décidé de travailler dans du méthanol-d4, une

comparaison directe entre le ratio des valeurs d’intégrations d’un signal caractéristique des stéroïdes à environ 5,70 ppm et le signal à environ 1,20 ppm des acides gras entre les deux solvant, nous a permis de noter une amélioration d’un facteur environ 30. (Figure 27B vs Figure 27A)

Figure 27 : Spectre RMN 1D, 1_{H de la formulation 3, enregistré dans (A) du chloroforme-d et (B) du méthanol-d}

4. TSP : référence

interne de déplacement chimique utilisée dans les solvants polaires, DMM : Diméthyl-maléate référence interne de déplacement chimique utilisée dans les solvants apolaires, AG : acide gras.

3.3.2.2 Expériences RMN qualitatives

Après avoir choisi le solvant, les 12 formulations ont été analysées de façon qualitative, la méthodologie est explicitée page 133 dans le matériels et méthodes. Tous les excipients annoncés à savoir le corps gras, l’alcool benzylique et le benzoate de benzyle ont bien été retrouvés dans l’ensemble des formulations. Cependant au niveau des actifs alors que chacune des formulations annoncent une composition différente, nous avons pu regrouper les formulations analysées en 3

0 2 4 6 8 ppm A TSP AG AG AG AG AG AG DMM DMM AG H2O CD2HOD Benzoate de benzyle + Alcool benzylique Benzoate de benzyle A lc o o l b en zy liq u e AG B

114 "familles" sans savoir dans ce premier criblage ce que chacune d’entre elles contenaient, les formulations 1, 8, 11 et 12 forment la première famille. A priori, il semble que ces formulations contiennent simplement 1 actif plus faiblement dosé que dans les autres formulations.

Les formulations 3, 4, 6, 7, 9 et 10 forment la deuxième famille. Ces formulations présentent des spectres avec une zone aliphatique légèrement plus complexe laissant présager la présence de divers esters de stéroïdes, à noter que la formulation 3 que nous détaillerons plus en détail se trouve dans cette famille.

La dernière famille se compose des formulations restantes à savoir les formulations 2 et 5. Et cette fois encore la zone aliphatique diffère par sa complexité de la première famille mais ne correspond pas non plus à celle de la deuxième famille.

Après une première analyse qualitative, nous pouvons faire le constat que quelques formulations annoncent des stéroïdes différents, à savoir des dérivés de testostérones, nandrolone, drostanolone, méthénolone, boldénone et trenbolone (Figure 28). Or, on n’observe dans l’ensemble des formulations qu’un seul signal pour les protons éthylénique (5,70 ppm), excluant d’ores et déjà la présence de drostanolone, méthénolone, boldénone et trenbolone ce qui constitue un premier résultat.

115

3.3.2.3 Analyse par spectrométrie de masse

Au vu de la complexité de différencier ces substances entre elles par RMN 1D 1_{H, chacune des}

formulations a été analysée par spectrométrie de masse haute résolution et en tandem, les paramètres expérimentaux sont explicités dans la partie expérimentale.

Ces analyses ont permis d'affiner la composition des trois « familles » que la RMN 1D 1_{H avait permis}

de mettre en évidence. En effet, comme montré pour le cas de Super BOLD en Figure 29A), la spectrométrie de masse permet de mettre en évidence la présence de propionate de testostérone ainsi que celle de cypionate de testostérone dont les ions pseudo moléculaires [M+H]+ _donnent

respectivement des masses de 345,2428 et 413,3054 pour des masses exactes calculées de 344,23515 et 412,29775 soit un écart moyen de l’ordre du ppm. La présence de ces substances a été confirmée par spectrométrie de masse en tandem (Figure 29B et Figure 29C), les fragments observés correspondent à ceux décrits dans la littérature41 _{et peuvent s’expliquer par les voies de fragmentation}

directement décrites sur les spectres ci-dessous. Le premier fragment correspondrait en effet à la perte du groupement propionate dans un cas et cypionate dans l’autre, permettant d’aboutir sur l’ion pseudo moléculaire de la testostérone elle-même. Ce dernier subit ensuite 2 déshydratations puis donne lieu aux 2 ions présentés dans les Figure 29B et Figure 29C.

100 % 0 400 300 200 500 600 700 800 900 1000 m/z 345,2428 413,3054 689,4774 757,5396 825,6016

A

116

Figure 29 : A) Spectres de masse en electrospray positif (ESI +_{) de la formulation 3, dans du méthanol avec une tension de cône}

de 30V ; B) Fragmentation du pic 345,2428 correspondant au propionate de testostérone de A) enregistré avec une énergie de collision de 15V ; C) Fragmentation du pic 413,3054 correspondant au cypionate de testostérone de A) enregistré avec une énergie de collision de 15V. 100 % 0 150 100 200 250 300 350 97,0650 109,0650 253,1956 271,2063 289,2168 346,2462 m/z -H2O -H2O

B

C

117 Bien que la spectrométrie de masse ne soit pas quantitative dans les conditions dans lesquelles nous avons travaillé, elle permet de mettre en évidence la présence de cette association propionate et cypionate de testostérone dans les formulations 1, 3, 4, 6, 7, 9 et 10. Ces résultats confortent ceux obtenus par RMN du proton et correspondent à ceux que nous avions appelés « famille 2 » avec une légère différence pour la formulation 1 qui semble d’après la spectrométrie de masse contenir une faible quantité de cypionate de testostérone. La plus grande sensibilité de la spectrométrie de masse peut expliquer cette différence. La SM permet également d'associer les formulations 2 et 5 qui contiennent également du propionate et du cypionate de testostérone, mais aussi une quantité à priori non négligeable d’énanthate de testostérone.

Les espèces étudiées étant très proches, nous pouvons faire l'hypothèse que leurs capacités à s’ioniser soit proches, si c’est bien le cas, la famille précédemment appelée « famille 1 » s’explique par la présence largement majoritaire de propionate de testostérone dans les formulations 11 et 12 et sa présence unique dans la formulation 8.

L’ensemble des stéroides détectés en spectrométrie de masse sont représentées en Figure 30 :

Figure 30 : Structures chimiques des substances détectées par spectrométrie de masse.