Afin de caractériser le rôle biologique de PRDM6, nous avons décidé de procédé à diverses analyses fonctionnelles qui permettront de découvrir l’impact de la suppression de ce gène dans une lignée cellulaire de cancer ovarien.
4.9.1 Essai de prolifération cellulaire
Un des paramètres à considérer lors de l’analyse fonctionnelle est la prolifération cellulaire qui est un bon indicateur du potentiel oncogénétique d’une lignée cellulaire. Pour ce faire, nous avons mesuré le temps de doublement des différentes lignées cellulaires étudiées afin de les comparer entre elles (Figure 16). Ce test détermine le temps requis pour que les cellules couvrent une surface deux fois plus grande. Ce n’est pas une expérience standard de doublement cellulaire.
Figure 16 : Analyse de l’effet de la suppression de PRDM6 sur temps de doublement des
différentes lignées cellulaires en utilisant la technologie xCelligence.
La suppression de PRDM6 n’a pas d’effet significatif sur le temps de doublement des lignées. Visuellement par contre, on peut vois qu’il semble y avoir une tendance à la diminution chez les lignées contenant l’ARN interférent.
4.9.2 Essai de formation de colonies
Cet essai donne non seulement une indication de potentiel prolifératif des lignées cellulaires, mais aussi de leur potentiel métastatique puisque seules les cellules pouvant former de nouvelles colonies après s’être accrochée au pétri seront comptabilisées lors de la lecture (Figure 17).
La suppression de PRDM6 diminue significativement le potentielle de formation de colonies des lignées n’exprimant pas la protéine comparativement à la lignée contrôle. On peut aussi observer que la lignée contrôle forme plus de colonies que la lignée SKOV3. Cette caractéristique peut être attribuable à l’insertion de l’ARN interférent dans le génome. Bien que cela ne soit pas indiqueé sur la figure, il y a aussi une
différence significative du nombre de colonies entre la lignée SKOV3 et les deux lignées n’exprimant pas PRDM6.
Figure 17 : Analyse de l’effet de la suppression de PRDM6 des différentes lignées
cellulaires sur la formation de colonies après 14 jours.
4.9.3 Essai de migration cellulaire
L’essai de migration par la méthode de la chambre de Boyden permet de vérifier la capacité de chaque cellule à migrer au travers de la membrane (Figure 18). Cette analyse a été effectuée en déposant sur la membrane les cellules qui seront attirées par chimioattraction vers la membrane. Si PRDM6 à une influence sur la migration des cellules, nous devrions voir une différence significative du nombre de cellules ayant migrées dans la membrane entre les lignées contrôles et les lignées n’exprimant plus le gène.
Figure 18 : Effet de l’inhibition de PRDM6 sur la migration des différentes lignées
cellulaires par la technique de chambre de Boyden.
Lors de cet essai, la moyenne des cellules ayant migré vers la surface inférieure de la chambre de Boyden pour la lignée cellulaire SKOV3 et la lignée CTRL C7 n’est pas significativement différente. Nous avons observé le même phénomène pour les lignées 1C5 X1 et 3C5 X4 qui ont une moyenne de cellules ayant migrées dans la membrane qui ne diffère pas de façon significative.
Par contre, nous avons pu observer une forte différence significative entre la migration des cellules de la lignée CTRL C7 comparativement aux cellules des lignées 1C5 X1 et 3C5 X4.
4.9.4 Essai d’invasion cellulaire
L’essai d’invasion par la méthode de la chambre de Boyden ressemble beaucoup à celle de la migration. Cependant, elle permet de vérifier la capacité invasive des cellules. Pour ce faire, on enduit la membrane de
Matrigel afin d’ajouter une matrice que les cellules devront traverser avant d’aller se loger dans la membrane de la chambre. À l’instar de l’essai de migration, on utilise le principe de la chimioattraction bien qu’il soit plus puissant lors de cet essai. Si PRDM6 à une influence sur l’invasion des cellules, nous devrions voir une différence significative de l’invasion du Matrigel par les cellules entre les lignées contrôles et les lignées n’exprimant plus le gène.
Figure 19 : Effet de l’inhibition de PRDM6 sur l’invasion des différentes lignées cellulaires
par la technique de chambre de Boyden.
Lors de cet essai, la moyenne des cellules invasives pour la lignée cellulaire SKOV3 et la lignée CTRL C7 n’était pas significativement différente. Par contre, nous n’avons pas observé le même phénomène chez les lignées n’exprimant pas PRDM6. En effet, il semblerait que les cellules du clone 3C5 X4 aient un potentiel invasif significativement plus faible que celui du clone 1C5 X1. Cette différence peut être expliquée par l’endroit où la construction plasmidique exprimant l’ARN interférent s’est inséré dans le génome chez chaque clone ou encore par le niveau de bloquage qui est différent entre les deux clones.
Tout de même, nous avons observé une diminution significative de la migration chez les lignées cellulaires n’exprimant pas le gène PRDM6 lorsqu’elles sont comparées à la lignée cellulaire utilisée comme contrôle lors de cette expérience.
4.9.5 Analyse de la cytotoxicité du Cisplatin et du Paclitaxel sur les cellules
Mesurer l’impact de la suppression du gène PRDM6 dans la réponse à certains agents chimiothérapeutiques couramment utilisés dans le traitement du cancer ovarien est très important pour bien caractériser son rôle fonctionnel. Pour ce faire, nous avons utilisé la méthode du MTS afin d’analyser les différentes lignées cellulaires. Ainsi, les cellules SKOV3, CTRL C7, 1C5 X1 et 3C5 X4 ont été traités par deux drogues, le cisplatin et le paclitaxel (taxol) pour une période de 72h.
Figure 20 : Analyse de la cytotoxicité des agents chimiothérapeutiques (Cisplatin et
Paclitaxel) sur les différentes lignées cellulaires étudiées.
Dans les deux cas la cinétique des courbes est sensiblement la même pour toute les lignées cellulaires. Par conséquent, on ne peut pas dire que la suppression de PRDM6 ait un impact sur la réponse au traitement pour ces deux agents chimiothérapeutiques. Les concentrations des drogues utilisées lors de cette expérience n’étaient pas assez élevées pour déterminer une IC50 pour toutes les lignées.