Chapitre I : Étude bibliographique
A. Caractérisation du colorant C.I Reactive Red 195
II. Analyse structurelle des formes du colorant par spectroscopie de masse
II.1. Principe de la technique
La spectrométrie de masse est une technique d’analyse structurale permettant de déterminer la structure des composés organiques solides, liquides ou gazeux. L’analyse se déroule en trois étapes. Les échantillons sont d’abord ionisés dans une source d’ionisation. Il se produit alors des ions qui peuvent être des ions moléculaires ou des fragments. Ces derniers sont séparés suivant leur masse sur la charge par le système dispersif et ils sont recueillis, en fin d’opération sur un détecteur.
Dans le cas des colorants étudiés, le système d’ionisation utilisé est de type Electrospray (ESI) puisque l’objectif de l’analyse c’est l’identification des différentes formes du colorant et de ne pas chercher la structure du colorant qui est bien connue. L’ionisation des molécules se déroule à pression atmosphérique et à une température variante, ce qui fait d’elle la plus douce de tous les modes d’ionisation existant (Impact électronique, Ionisation chimique, Désorption par
effet de champ, bombardement atomique rapide). Le principe est simple, l’échantillon en solution est introduit par un capillaire de diamètre 50µm dans la source d’ionisation après séparation effectuée par HPLC. Sous l’action d’un gaz nébuliseur (N2) et d’un champ électrique (3 à 5 kV), on crée un fin brouillard de gouttelettes polychargées qui se divisent continuellement jusqu’à l’obtention des ions mono ou polychargés. Ces derniers arrivent dans un analyseur de type ion trap ou piège à ion. Ce système dispersif fonctionne comme un quadripôle circulaire qui permet de séparer les ions suivant le rapport m/z avec une résolution unitaire. Cependant, la forme circulaire de ce système permet de stocker les ions à l’intérieur de l’enceinte de façon à augmenter leur nombre et accroître leur sensibilité [108].
L’analyse des colorants par LC/MS-ESI est très documentée. Les travaux de Holcapek et call.
[96] ont permis la séparation et la détermination structurelle de plusieurs colorants polysulfonés,
y compris les colorants réactifs type C.I. Reactive Green 8 et Reactive Blue 109. En utilisant une colonne en phase polaire inverse (C18) avec une phase mobile en gradient linéaire, ces auteurs ont testé plusieurs solutions tampon (l’acétate de dihexylammonium, l’acétate d’amonium et l’acétate de trialkylammonium) avec de l’eau et du méthanol comme phase mobile. Le tampon acétate de dihexylammonium a été retenu comme solvant compatible pour la séparation et la détermination des masses des colorants polysulfonés. En effet, d’une part il permet une rétention de ces colorants et d’autre part, il est suffisamment volatile dans le système de l’Electrospray. L’acétate d’ammonium est compatible quant à lui dans le cas des colorants mono et disulfonés
[96,97].
Dans notre travail, nous avons utilisé de l’acétate d’ammonium avec de l’eau et de l’acétonitrile en LC/ESI_MS (voir partie expérimentale). Dans ce cas, le colorant sel est transformé en colorant acide. Autrement dit, les sodiums sont substitués par les protons. Cela permet d’augmenter la rétention de ces colorants polysulfonés en diminuant leur solubilité dans la phase mobile.
II.2. Détermination des masses de différentes formes du colorant C.I Reactive Red
195.
Pour détecter les différentes formes du colorant étudié, nous avons d’abord couplé l’HPLC à un détecteur à barrette diode. Le solvant utilisé est eau –acétonitrile avec l’acétate d’ammonium à pH 6. Le chromatogramme obtenu de ce mélange à la longueur d’onde 250 nm est illustré par la Figure 3.
Fig. 3. Chromatogramme du colorant : Reactive Red 195.
Fig. 4. Spectre de masse (LC/ESI_MS) du colorant Reactive Red 195.
Le chromatogramme du colorant Reactive Red 195 montre essentiellement deux pics qui peuvent être attribués aux différentes formes. Afin d’élucider la structure de ces différentes formes, nous avons réalisé un couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse en mode Electrospray (LC/ESI_MS). Le courant ionique obtenu par LC/ESI_MS confirme la présence de deux pics majoritaires. Leurs spectre de masse en mode négative est illustré par la
Le pic 2 correspond au produit majoritaire. Son spectre de masse est illustré par la Figure 4A. Après examen du spectre, nous sommes arrivés à distinguer les masses m/z attribuables aux
structures données par le Tableau 3. Ces structures sont illustrées sur le Schéma 6’ (voir Annexe p.213). Pour des facilités d’écriture, nous présentons la structure de la partie chromophore du colorant par D.
Tableau 3. Masses détectées pour les formes du colorant commercial Reactive Red 195
Composé Ion fragment/moléculaire Masse/charge (m/z) Formule brute
D-MCT-SES [M-H]- 1024 C31H23N7O19S6Cl
D-MCT-VS [[M-H2SO4]-H]- 926 C31H21N7O15S5Cl D-MCT-HES [[M- HSO4 +OH-]-H]- 944 C31H23N7O16S5Cl D-CH3 [[M-C10LiH9+O]-H]13N-4S4Cl + 476 C21H14O6N3S2 Li
Le pic moléculaire à m/z = 1024 correspond à [M-H]- et à l’amas isotopique observé sur le spectre de la Figure 4A. L’abondance de ces ions correspond aux ions à m/z =1025, 1026, 1027 et 1028 pourra être déterminé théoriquement en tenant compte de tous les isotopes des éléments
chimiques de la formule acide du colorant : C31H24N7O19S6Cl. Elle sera déterminée par le développement des polynômes suivants :
(a+b)31(c+d)23(e+f)7(g+h+i)19(j+k+l+m)6(n+o) a et b représentent l’abondance du carbone 12 et 13 ;
c et d représentent l’abondance de l’hydrogène et du deutérium ; e et f représentent l’abondance de l’azote 14 et 15 ;
g, h et i représentent l’abondance de l’oxygène 16, 17 et 18; j, k, l et m représentent l’abondance du soufre 32, 33, 34 et 36 ; n et o représentent l’abondance du chlore 35 et 37.
Le développement, par le système Brûker 3000 de LC/ESI_MS , de ces polynômes a donné les abondances suivantes :
Tableau 4. Abondances relatives des ions isotopiques calculés par le système Brûker 3000.
Abondance relative
calculée par Brûker. (%)
Abondance
relative exp. (%) Ion isotopique Masse/charge (m/z)
100 100 M 1024
42 72 M+1 1025
72 76 M+2 1026
22 52 M+3 1027
Sur le spectre, on peut distinguer les cinq ions isotopiques mentionnés dans le tableau. Cependant, les abondances des ions isotopiques M+1 et M+3 observées sur le spectre sont différentes de celles calculées théoriquement par Brûker (Tableau 4). Pour justifier ces différences, nous avons procédé au calcul manuel des abondances. Les résultats sont regroupés sur le Tableau 5.
Tableau 5. Tableau comparatif entre les abondances relatives des ions isotopiques. Abondance relative
calculée par Brûker. (%) Abondance relative exp. (%) Abondance relative calculée manuellement (%) Ion isotopique 100 100 100 M 42 72 54 M+1 72 76 63 M+2 22 52 46 M+3 20 24 12 M+4
*L’abondance relative P(M+1)=35/(100-35)=54% est due aux abondances naturelles des éléments de la formule du colorant multipliés par le nombre de ces éléments: 13C (1 x 27= 27%), 17O (0.04 x 19= 0.76%), 15N (0.36 x 7= 2.52%) et 32S (0.79 x 6= 4.74%).
*L’abondance relative P (M+2)=25/(65-25) = 63 % est due à l’abondance naturelle du 37Cl (25 x1 = 25%).
* L’abondance relative P (M+3)=12/(40-12)= 46% est due à l’abondance naturelle du 34S (4.21 x3 = 12%).
* L’abondance relative P (M+4)=3/(28-3)=12% est due à 3 % de l’abondance relative de 13C et du 34S. Chaque molécule contient à la fois un carbone 13C et un soufre 34S.
On déduit que les abondances calculées manuellement sont les plus proches de celles déterminées sur le spectre de masse.
La Figure 4B est le spectre ESI_MS du pic 1 (Fig.3) à m/z = 476 qui correspond à la formule brute C21H14O6N3S2Li. Cette molécule résulte des produits de synthèse du colorant (produit secondaire), et qui représente une forme inactive du colorant. Cependant, le lithium (Li), qui peut se trouver dans le solvant d’acétonitrile, a substitué le sodium (Na) du groupement sulfato (-NaSO3).
La Figure 4C correspond au spectre de masse obtenu par LC / ESI_MS du pic 3 (Fig.3) du mélange du colorant : Reactive Red 195. Ce spectre montre la présence d’un composé de masse moléculaire 926 g/mol. Il correspond à la formule brute C31H21N7O15S5Cl (forme active du colorant : D-MCT-VS). Nous constatons aussi la présence d’un autre composé de masse 944
g/mol qui peut être le résultat d’une fragmentation de la molécule mère de masse 1024g/mol par réaction d’élimination (Schéma 6’). Ce dernier composé correspond à la formule brute C31H23N7O16S5Cl (forme partiellement hydrolysée : D-MCT-HES).