Analyse des structure des résidus osidiques d'hétérosides par perméthylation et chromatographie en phase gazeuse

5.1 Introduction

Les groupements hydroxyles libres de l'hétéroside sont méthylés (Hakomori, 1964) puis celui-ci est hydrolysé, libérant ainsi un ou plusieurs oses partiellement méthylés, qui après réduction et acétylation pourront être estimés quantitativement par

CH3 CH 3

S O ₊ NaH ₊ H2

Formation de l'anion

DMSO hydrure de sodium anion diméthyl sulfynile

+ Formation 4 4 3 Attaque SN2 Perméthyl glucoside + R O O OCH OCH OCH OCH R O O O Na O Na O Na O Na R O O OH OH OH O OH O Réaction de perméthylation 3 ₃ 3 3 CH 2 CH S O 3 Na⁺ -CH 2 CH S O 3 Na⁺ -CH 3 CH S O 3 de l'alkoxyde par le ICH hétéroside p-coumaroylé - + _-+ - + -+ HO OH O +

anion diméthyl sulfynile

acide p-coumarique DMSO

Figure 45: Réactions de méthylation d'hétérosides (R = flavonoïde).

Chromatographie en phase gazeuse (Figure 45). Les groupements méthyles étant portés

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hydroxyles libres ou engagés dans une liaison labile en milieu alcalin de type ester), on peut pour chaque résidu partiellement méthylé déterminer le nombre et la position des carbones impliqués dans une liaison glycosidique (Aspinall, 1982). Cette technique permet donc d'identifier les oxygènes engagés dans les liaisons interosidiques ou entre une ose et un aglycone.

5.2. Principe de la réaction de perméthylation (Figure 45)

Le(s) résidu(s) osidique(s) du flavonoïde sont transformé(s) en polyalkoxyde par déprotonation des hydroxyles libres par une base forte (ici l'anion diméthyle sulfinyle de sodium). Ce polyalkoxyde réagit par attaque nucléophile (SN2) avec un agent alkylant (ici l'iodure de méthyle) pour former des éthers méthyliques (Figure 45). Les échantillons sont dissouts dans le DMSO (diméthylsulfoxyde), selon la méthode d'Hakomori (1964), décrite par Jansson et al. (1976).

5.3. Mode opératoire

a) Introduction

L'ensemble des opérations se réalise sous atmosphère d'azote et dans une vaisselle parfaitement propre et sèche, l'hydrure de sodium et l'anion réagissant violemment avec l'eau. D'autre part, en raison de la haute toxicité des réactifs (anion et iodure de méthyle), les manipulations sont conduites sous hotte aspirante et avec des gants.

b) Préparation de l'anion diméthyle sulfynile

Dans un Erlenmeyer de 100 ml, on introduit 1,6 g d'hydrure de sodium (80 % dans l'huile blanche, FLUKA A.G., Suisse). L'erlenmeyer est bouché et purgé avec de l'azote. Le

milieu est lavé avec 3 × 20 ml de pentane sous atmosphère d'azote, puis séché sous courant

d'azote. On ajoute ensuite 25 ml de DMSO. L'erlenmeyer est ensuite placé dans un bain d'huile à 60-70°C, avec agitation magnétique et sous courant d'azote pendant environ 2 heures. On obtient alors un anion de couleur vert kaki clair, qui peut être conservé plusieurs mois au congélateur. L'anion ainsi préparé a une molarité d'environ 2M, titrable par du méthanol anhydre en utilisant comme indicateur coloré quelques gouttes de triphénylméthane à 0,5% dans le tétrahydrofurane (rouge en présence de base) (1 µl de CH3OH correspond à une molarité de 0,025 M).

91 c) Méthylation des échantillons

L'échantillon contenant l'hétéroside lyophilisé (0,6 mg) est disposé dans un pilulier de 5 ml et passé à l'étuve à 110°C pendant 1 heure. Le pilulier est bouché à l'aide d'une vanne en Téflon. Après l'ajout de 0,5 ml de DMSO, l'échantillon est purgé avec de l'argon et laissé avec agitation magnétique jusqu'à dissolution complète. Le milieu est ensuite additionné de 0,5 ml d'anion, puis purgé à l'azote et laissé en contact une nuit sous agitation. Le pilulier est ensuite refroidi dans la glace et 0,5 ml d'iodure de méthyle est rajouté. La réaction entre l'iodure de méthyle et le polyalkoxyde étant très exothermique, le mélange réactionnel, solidifié au froid, se liquéfie. On laisse sous agitation et atmosphère d'azote, à température ambiante, pendant 1 heure. Le pilulier est alors ouvert et laissé à l'air pendant 15 minutes afin d'éliminer l'iodure de méthyle en excès. Le milieu est alors repris par 2 ml du mélange chloroforme/méthanol (2/1, v/v) puis transféré dans un tube à centrifuger avec bouchon à vis. Le DMSO est éliminé par

lavages avec 3 × 2 ml d'eau. Les phases aqueuses sont éliminés et la phase chloroformique

contenant le flavonoïde permethylé est amené à sec sous courant d'air (40°C).

d) Hydrolyse des hétérosides méthylés et dérivatisation

L'hydrolyse de l'hétéroside permethylé est réalisée à l'acide trifluoroacétique (TFA) et la dérivatisation de l'ose (ou des oses) neutre(s) partiellement méthylé(s) est réalisé selon le protocole décrit dans §.3. de ce Chapitre.

e) Séparation et identification des acétates d'alditols méthylés

La séparation des acétates d'alditol partiellement méthylés est réalisée en parallèle sur trois colonnes capillaires, dont une (DB wax) est couplée au spectromètre de masse. Ceci permet une meilleure identification des éthers méthylés. Les colonnes sont:

* DB-1 (J&W Scientific, Folsom, CA USA): colonne capillaire en silice fondue (50 m × 0,32

mm) portant une phase OV-1 greffée (épaisseur du film 0,2 µm). Conditions opératoires:

- Injection en split (fuite 30 ml/min), gaz vecteur hydrogène (70 kPa) - Température de l'injecteur et du détecteur: 250°C

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- Température de la colonne: isotherme à 145°C pendant 10 min, puis montée à 190°C (15°C/min)

* DB-225 (J&W Scientific, Folsom, CA, USA): colonne capillaire en silice fondue (30 m × 0,32

mm) portant une phase OV-225 greffée (épaisseur du film 0,25 µm). Conditions opératoires: - Injection en split (fuite 30 ml/min), gaz vecteur hydrogène (65 kPa)

- Température de l'injecteur et du détecteur: 250°C

- Température de la colonne: isotherme à 170°C pendant 15 min, puis montée à 210°C (5°C/min)

* DB-wax (J&W Scientific, Folsom CA, USA): colonne capillaire en silice fondue (30 m × 0,32

mm) portant une phase greffée (épaisseur du film 0,25 µm). Conditions opératoires:

La colonne DB-wax, a été couplée à un spectromètre de masse Hewlet Packard MS Engine 5989 A, impacte electronique, avec une énergie d'ionisation de 70 eV. La température de la source a été de 250°C, la température du quadripole de 120°C, mode scan (29 u.m.a. à 350 u.m.a.), 1,3 scan par seconde. La ligne de transfert est maintenue à 250°C. Les conditions chromatographiques sont: gaz vecteur hélium (1,3 ml/min, vitesse linéaire 41,2 cm/s). Volume injecté 1µl, injection on-column à 30°C et montée à 250°C (180°C/min), puis maintenue à 250°C pendant 80 min, four à 35°C et montée à 60°C (160°C/min) puis à 240°C (3°C/min) pendant 60 min, puis maitenue à 240°C pendant 60 min.

f) Identification

L'identification des pics est réalisée sur la base des temps de rétention relatifs trouvés

dans la littérature (Barreto-Bergter et al., 1981; Basic et al., 1984; Harris et al., 1984; Lomax

et al., 1985) et d'après les tables de temps de rétention établies au laboratoire par Saulnier (1987) en méthylant différents polysaccharides de structure connue. L'identification des pics sur la base des temps de rétention est confirmée en couplage CPG/MS au Laboratoire des Arômes et Substances Naturelles de l'Institut des Produits de la Vigne (INRA, Montpellier).

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