1. Étude bibliographique :
L'élucidation de la structure de benzodiazépines est généralement réalisée par une combinaison de méthodes spectroscopiques, comme la spectrophotométrie (UV), la résonance magnétique nucléaire (RMN), la spectrométrie de masse (MS) [167-169].la MS est l'une des méthodes physico-chimiques les plus importante en raison de sa sensibilité, de la rapidité et de faibles niveaux de consommation d'échantillon.
La spectrométrie de masse en tandem couplé à la source FAB ''bombardement d'atomes rapides'' a été employé pour la caractérisation structurale de huit composés dérivés de la 1,4-benzodiazépine. Les deux ions positifs et négatifs ont conduit, dans tous les cas examinés, à la production d'espèces moléculaires abondantes. Des collisions effectuées sur ces ions ont donné lieu à l'identification des ions produits, qui pourrait être liée à la structure d’origine [170].
La spectrométrie de masse de type trappe ionique couplée à la source ESI ''Ionisation par électronébulisation'' a été réalisé n fois (dite MSn) afin d'élucider les voies de dégradation
benzodiazépines
125
des dérivés de la 1,4-benzodiazépine et leurs fragmentations ultérieures [171]. Dans cette étude, l'effet de différents substituants sur le processus d'ionisation / fragmentation, a été révélé, confirmant qu’il s’agit d’une technique utile et efficace dans la caractérisation de cette importante classe de médicaments et de leurs métabolites [172]. L’analyse de dérivés de la benzodiazépine (flumazénil, zaleplone, zolpidem et zopiclone), a été effectuée dans le plasma à pression atmosphérique par chromatographie liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse en tandem, en utilisant la source d’ionisation chimique (APCI-MS / MS) [173]. En outre, une procédure de dépistage de benzodiazépines hypnotiques dans les cheveux au pg / mg, a été décrite pour le dépistage de 16 différents 1,4-benzodiazépines hypnotiques dans les cheveux humains par LC utilisant ESI-MS / MS [174]. De même, une autre étude a été effectuée fait sur les cheveux et le plasma chez le rat, permettant la détermination de
benzodiazépines à propriétés hypnotiques (alprazolam, l'estazolam, et midazolam) et de leurs métabolites par chromatographie liquide en phase inverse couplée avec la spectrométrie de masse, en utilisant électrospray comme méthode d’ionisation [175]. Une haute résolution ESI- IMS-MS (la spectrométrie de mobilité ionique (IMS) couplée à la spectrométrie de masse (MS)), a été utilisée pour évaluer la séparation des benzodiazépines dans des échantillons biologiques ; ESI peut être une source d'ionisation idéale pour réaliser l'analyse des
benzodiazépines [176]. Récemment, le nitrazépam, le norfludiazepam, le lorazépam et d'autres 1,4-benzodiazépines, ont été analysés par ESI avec un spectrométre de masse de type trappe - ion linéaire [177]. Il a été montré que les 1,4-benzodiazépines protonées se dissocient dans la phase gazeuse selon une voie privilégiée correspondant à la perte du monoxyde de carbone (CO).
En conséquence, ESI-MS peut être considérée comme un outil puissant pour identifier les 1,4-benzodiazépines naturelles et / ou synthétiques. Cependant, une étude systématique et approfondie du comportement de 1,5-benzodiazépines par ESI-MS et ESI-MS / MS est très peu décrite dans la littérature. A notre connaissance, la 7-chloro-1,5-dihydro-1-méthyl-5- phényl-1,5-benzodiazépine 2,4 (3H) -dione (clobazam) est la seule 1,5-benzodiazépine qui a fait l’objet d'une première analyse spectrale de masse [178]. En outre, une étude structurale ultérieur a été réalisée sur le clobazam par LC-MS/MS [179] et EI-GC-MS [177] afin de le mettre
en évidence dans le sérum humain, par chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse tandem, et dans le sang par EI-GC-MS.
Ainsi, nous a-t-il paru intéressant de réaliser une étude par ESI-MS / MS de nouveaux dérivés de la 1, 5-benzodiazépine. Il est important d'étudier les voies de fragmentation, en
benzodiazépines
126
phase gazeuse, de ces composés, afin de corréler leurs structures chimiques aux propriétés pharmacologiques, dans le but d'aider à l'identification rapide et à l'analyse des composés ayant une importance pharmacologique.
Poursuivant-nos travaux de recherche sur l'élucidation de la structure précise et la répartition de fragmentation de nouvelles biomolécules [170, 180-187]. Nous présentons dans ce travail une étude en spectrométrie de masse de trois nouveaux benzodiazépines synthétiques réalisée avec un instrument hybride conventionnel de haute résolution ESI- quadripôle- orthogonal-temps de vol (QqTOF) -MS / MS, et avec un spectromètre de masse conventionnel en tandem de type quadripôle-hexapôle-quadripôle (QhQ).
Nous présentons également les méthodes de fragmentation à basse énergie CID -MS / MS (dissociation induite par collision) pour fragmenter les molécules protonées sélectionnées et analyser par un quadripôle d’un spectromètre de masse de type QhQ-MS / MS.
Les trois nouveaux dérivés de la 1,5-benzodiazépine 265, 274 et 275, sont représentés dans la Figure1. A notre connaissance, la littérature ne décrit aucune étude relative à la caractérisation par spectrométrie de masse de ce type de composés, utilisant l’ESI comme méthode d’ionisation.
benzodiazépines
127 2. Partie expérimentale :
2.1. ESI-QqTOF-MS et ESI-QhQ-MS
Le spectromètre de masse hybride API QSTAR XL MS / MS -QqTOF (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a été utilisé avec une haute résolution de masse. L'analyse par ESI-MS-QqTOF a été obtenue avec une source Turbo Ionspray fonctionnant à 5,5 kV à une température de 80°C, avec toutes les acquisitions effectuées dans le mode d'ion positif. Les échantillons ont été introduits dans le spectromètre de masse avec une pompe à seringue Harvard intégrée à un débit de 0,1 mL / min. L'étalonnage de la masse de l'analyseur TOF en mode ion positif, a été réalisé avec la source Turbo Ionspray, en utilisant le penta-O-acétyl-b D-alactopyranose et en tenant compte des masses exactes de l’ion [M+H-AcOH] +
([C14H19O9]) à m / z 331,1024. L'étalonnage des masses les plus élevées, a été réalisé avec l'octa-O-acétyl-bD-lactopyranose et l’identification de l'ion [M+H-AcOH] + ([C26H33O17]) à m / z 617,1712.
Les spectres de masse ESI (ESI-MS en mode positif) ont également été enregistrés avec un spectromètre de masse quadripôle – hexapôle -quadripôle (QhQ) équipé d'une source ESI méga-débit et capable d'analyser des ions jusqu'à m / z 4000 (Waters / Micromass, Manchester, Royaume-Uni). Un ordinateur personnel (Compaq, processeur PIII 300 MHz, fonctionnant sous Windows NT 4, le service pack 3) équipé d'un logiciel de système de données de la spectrométrie de masse, a été utilisé pour l'acquisition et le traitement des données. La température de la source ESI a été maintenue à 75°C. La tension de
fonctionnement du capillaire est de 3.00kV et la lentille à haute tension a été fixée à 0.40kV durant toute l'opération. Les spectres de masse ESI ont été enregistrés à une tension de cône de 25V. Les spectres de masse ESI classiques ont été obtenus par balayage dans le mode d'analyse à canaux multiples (MCA - Multi Channel Analyser) *, avec un temps d'analyse de 1 s par 250 m / z unités. Les spectres de masse étaient en moyenne de 20-30 scans. L'échelle de masse a été calibrée dans le mode d'ions positifs en utilisant un mélange polyéthylène glycol.
(*) : MCA (Multi Channel Analyser) compte et classe les impulsions électriques mesurées en fonction de leur amplitude
➜ Spectre = Histogrammes donnant le nombre de photons détectés dans chaque intervalle d’amplitude (=canal).
benzodiazépines
128
À basse énergie CID-MS / MS avec le spectromètre de masse en tandem QhQ, les spectres des ions produits ont été obtenus sur l'instrument décrit ci-dessus. L'azote est utilisé comme gaz de collision de MS / MS avec des énergies de collision variant entre 10 et 35 eV. L'énergie de collision (CE) et les conditions de gaz CID ont été ajustées dans chaque
acquisition, de telle sorte que l'ion précurseur reste abondant dans les spectres. En mode descendant, l'ion à étudier est sélectionné en focalisant le premier quadripôle (Q1) sur son rapport m/z. Les fragments formés dans la cellule de collision -hexapôle- sont séparés par le deuxième quadripôle (Q2) et analysés à partir de m / z 100 à 500. Le spectre obtenu présente à la fois l'ion précurseur (ou ion parent) et ses ions fragments (ou ions produits).
En outre, la ré-confirmation des diverses voies de fragmentation établie, a été effectuée par CID dans la source (in-source CID), sur le même instrument. Des
fragmentations supplémentaires ont été réalisées en variant la différence de potentiel (ddp) dans l'interface (pression atmosphérique/ vide) jusqu'à ce que les ions fragments
caractéristiques aient été observés dans les spectres de masse ESI. Ces ions ont, ensuite, été sélectionnés en tant que ions précurseurs pour la deuxième génération subséquente des acquisitions CID-MS / MS. Les conditions de fragmentation sont les mêmes que dans les expériences CID-MS / MS décrit précédemment.
2.2. Spectres d'ions précurseurs mesurés avec le spectromètre de masse en tandem QhQ.
Les expériences de balayage de l'ion précurseur, ont été enregistrées avec un spectromètre de masse QhQ (quadripôle - hexapôle- quadripôle), équipé d'une source ESI. Dans le mode ascendant, le second quadripôle (Q2) a eu lieu à des valeurs m/z fixe pour mesurer l'apparition d'ion produit particulier, produit par collision dans l’hexapôle avec l'argon dans le RF- seulement (m/z 118.69, 146,48, 194,12, 208,47 et 221,80 pour la benzodiazépine 265 et m/z 118,59, 172,85, 234,79. 277,56, 322,77 et 355,62 pour le benzodiazépine 275) tandis que le premier quadripôle (Q1) a été balayé pour les ions précurseurs correspondant à partir de m/z 100 à 500. Un ordinateur personnel a été utilisé pour l'acquisition et le traitement des données. La température de la source ESI était 70°C.
benzodiazépines
129 3. Résultats et discussions
3.1. Analyse à haute résolution ESI – MS - QqTOF des dérivés de la 1,5- benzodiazépines 265, 274 et 275
Les benzodiazépines 265, 274 et 275 hautement purifiés ont été introduites par infusion dans la source ESI, sans qu'il soit nécessaire de faire une séparation
chromatographique préalable. Ainsi, les molécules protonées [M+H]+ et les principaux ions fragments (formés dans la source) obtenus avec le QqTOF-MS, instrument hybride à haute résolution, étaient libres de toute analytes au niveau de trace d'élution d'un système HPLC, avec une grande partie de la matrice de fond, qui pourrait donner lieu à des multiplets de masse.
Les spectres de masse à haute résolution ESI-QqTOF (mode d'ions positifs) des trois 1,5-benzodiazépines 265, 274 et 275 ont été enregistrés avec une différence de potentiel de 30V et exposés les molécules protonées et cationisées au sodium comme indiqué dans le tableau 1.
Tableau 1. Haute résolution en une seule étape ESI-QqTOF-MS (mode positif) pour les benzodiazépines 265, 274 et 275
BD Numéro
attribué Ion caractéristique (%)
m / z Calculé m/z observé Différence de ppm 265 [C19H20N2O4] [C19H20N2O4Na]+,[M+Na]+ 21.4 363.1315 363.129 4.4 265a [C19H21N2O4]+, [M+H]+ 100.0 341.1496 341.146 9.3 265i [C19H19N2O3]+ 22.8 323.1390 323.138 1.3 265g [C17H15N2O3]+ 14.5 295.1077 295.106 5.4 265b [C17H21N2O2]+ 32.4 283.1441 282.134 35.6 265h [C16H15N2O2]+ 26.3 267.1128 221.087 12.7 265j [C11H13N2O3]+ 12.3 221.0921 209.106 21.2
benzodiazépines
130 265e [C14H13N2]+ 13.8 209.1073 195.090 5.2 265d [C13H11N2]+ 35.2 195.0917 119.058 8.7 265f [C7H7N2]+ 20.4 119.0604 267.109 12.5 274 [C25H23N3O3]+ [C25H23N3O3Na]+,[M+Na]+ 30.8 436.1632 436.158 9.8 274a [C25H23N3O3]+,[M+H]+ 100.0 414.1812 414.180 1.9 274h [C25H22N3O2]+ 48.4 396.1707 396.170 1.7 274b [C23H22N3O]+ 30.6 356.1757 356.169 16.2 274f [C23H19N2]+ 28.8 323.1543 323.149 13.6 274d [C17H17N3O]+ 31.6 278.1288 278.119 31.9 274e [C10H9N2O] + 34.5 173.0709 173.069 6.3 274c [C7H7N2]+ 23.7 119.0604 119.058 13.4 275 [C25H22N3O3Cl]+ [C25H22N3O3ClNa]+,[M+Na]+ 38.4 12.6 470.1242 472.1244 470.124 472.119 4.8 5.5 275a [C25H22N3O3Cl] +,[M+H]+ 100.0 33.2 448.1422 450.1405 448.138 450.138 8.0 4.6 275b [C23H21N3OCl]+ 42.4 14.0 390.13683 92.1348 390.129 392.128 19.7 15.0 275f [C23H18N2Cl]+ 39.2 13.0 357.1153 359.1132 357.108 359.102 19.3 28.9benzodiazépines
131 275q [C10H9NOCl]+ 28.2 9.3 194.0367 196.0340 194.029 196.029 36.0 21.4 275e [C10H9N2O]+ 38.2 173.0709 173.068 11.5 275c [C7H7N2]+ 26.5 119.0604 119.059 6.7⧫ Le spectre de masse ESI de la 1,5-benzodiazépine 265 ainsi obtenu présente un pic minoritaire correspondant à l’espèce cationisée au sodium (m/z 363,1299 ; Δm/z = 4,4 ppm) et un pic majoritaire correspondant à l’espèce protonée (m/z 341,146 ; Δm/z = 9,3 ppm).
⧫ Le spectre de masse ESI de la 1,5-benzodiazépine 274 ainsi obtenu, présente un pic minoritaire correspondant à l’espèce cationisée au sodium (m/z 436,1589 ; Δm/z = 9,8 ppm) et un pic majoritaire correspondant à l’espèce protonée (m/z 414,1804 ; Δm/z = 1,9 ppm).
⧫ Le spectre de masse ESI de la 1,5-benzodiazépine 275, ainsi obtenu, présente un pic minoritaire correspondant à l’espèce cationisée au sodium (m/z 470.1219 pour (35Cl) ; Δm/z =
4,8 ppm et m / z 472.1198 pour (37Cl) ; Δm/z = 5,5 ppm) et un pic majoritaire correspondant à l’espèce protonée (m/z 448,1386 pour (35Cl) ; Δm/z = 8 ppm et m / z 450,1384 pour (37Cl) ;
Δm/z = 4,6 ppm).
Par conséquent, la présence de l'atome de chlore dans le composé 275 a été déduite aisément par le profil isotopique (3 : 1) des molécules protonées et cationisées au sodium.
Il convient de noter que l'augmentation de la différence de potentielle (ddp) de 30 à 40 Volts a amélioré les voies de fragmentation des molécules protonées étudiées, et par
conséquent, amélioré la production des ions fragments caractéristiques qui ont été mesurés par haute résolution QqTOF-MS pour leurs masses précises et exactes.
La mesure précise de la masse, nous a permis d'établir et de limiter les possibilités des éventuelles formules et les structures précises de ces ions (tableau 1). Les analyses par ESI- QqTOF-MS ont permis la déduction de la masse moléculaire des benzodiazépines 265, 274 et 275 synthétisées, qui étaient en accord avec les structures représentées dans la figure 1.
3.2. Analyse à haute résolution ESI – QhQ – MS des dérivés de la 1,5- benzodiazépines 265, 274 et 275
Afin de caractériser les voies de fragmentation par ESI-QqTOF-MS des nouveaux 1,5- benzodiazépines 265, 274 et 275, des analyses à basse énergie CID-MS / MS de différentes
benzodiazépines
132
molécules protonées 265, 274 et 275, ont été réalisées sur l’instrument hybride conventionnel de type QhQ-MS / MS (balayage des ions produits et des ions précurseurs), conduisant à la formation d'une série d’ions produits diagnostiques. En conséquence, il est devenu nécessaire de mesurer le spectre de masse ESI, en une seule étape de la benzodiazépine 265, qui a été enregistré avec le même instrument QhQ-MS / M ; en effet, le spectre de masse, pris par ESI de la benzodiazépine 265 (ddp = 40 V), fournit une molécule protonée [M+H]+ à m / z 341 (Fig. 2 (A)).
Figure 2(A). Spectre d'ESI-MS du composé 265, enregistré avec un spectromètre de masse
QhQ avec une différence de potentiel de 40 V
L'augmentation de la ddp à 60 V a permis d’améliorer la dégradation des molécules protonées dans divers diagnostiques des ions fragments, sans affecter la molécule cationisées au sodium [M+Na]+ à m / z 363 (Figure 2 (B)).
Figure 2(B). Spectre d’ESI- MS du composé 265 enregistré avec un spectromètre de masse
benzodiazépines
133
La formation et les structures proposées des ions produits obtenus par différents balayages, seront discutées dans les sections suivantes.
3.3. Recherche d'ions fragments
L'analyse, à basse énergie CID-MS / MS, des molécules protonées obtenues à partir de dérivés de benzodiazépine 265, 274 et 275, a été réalisée grâce à un le spectromètre de masse conventionnel QhQ en tandem
3.3.1. Le composé 265 (m / z 341) :
Les analyses par Collision à basse énergie CID-MS / MS, ont été effectuées en vue de déterminer les voies de fragmentation, conduisant à la formation des différents ions produits observés dans le spectre de masse conventionnel, obtenu à des tensions différentes de
fragmentation. L'analyse d'ions fragments de l'ion 265a [M+H]+ à m / z 341 a été réalisée avec un CE de 50 eV et une ddp de 20 V (Fig. 3).
Figure 3. L'analyse des ions produits [M+H]+ générés à partir de l’ion 265a m / z 341
Le spectre met en évidence les principaux ions fragments à m / z 107, 119, 147, 195, 207, 209, 221, 249, 267, 283, 323 et 295 (Tableau 2).
Tableau 2. Analyse CID-MS / MS à basse-énergie de la benzodiazépine protonée 265
réalisée avec le spectromètre de masse conventionnel QhQ en tandem
Ions Précurseurs choisis [M+H]+ Ions fragments observés
341 (265a) 341 (265a), 323 (265i), 295 (265g), 283
(265b), 267 (265h), 237 (265c), 221 (265j), 209 (265e), 207 (265m), 195 (265d), 175 (265k), 147 (265l), 119 (265f)
benzodiazépines
134
Schéma 1. Les voies de fragmentation proposées en phase gazeuse de la molécule protonée
265a à m / z 341, observées par le CID-MS / MS.
265 i 265 f 265 e 265 m 265 c 265 b 265 d m /z : 1 9 5 265 a 2 6 5 j 265 l 265 f 265 h m /z :2 6 7 265 g
benzodiazépines
135
La molécule protonée 265a à m/z 341 élimine le glyoxal pour donner l'ion fragment à m/z 283, de structure benzimidazoline 265b. Ce dernier, élimine l'éthanol pour produire l'ion 265c à m/z 237.
L'ion 265b peut également perdre de l'acétate d'éthyle pour donner l'ion protoné 265d à m / z 195 de structure 2-phénylbenzimidazole. Il est à noter que l'ion fragment 265d peut aussi être formé à partir de la molécule protonée 265a par l'élimination successive du glyoxal et de l'acétate d'éthyle. L'ion 265b peut également éliminer le formiate d'éthyle pour donner l'ion fragment 265e à m / z 209, et enfin 265b peut subir l'élimination successive du benzène et de l’acétate d'éthyle pour donner l'ion 265f à m / z 119. Ce dernier peut également être formé à partir de la molécule protonée 265a par élimination successive du glyoxal, du benzène et de l’acétate d'éthyle.
La molécule protonée 265a à m / z 341 peut également éliminer l'éthanol et donner l'ion fragment 265g à m / z 295, qui perd CO pour donner l'ion 265h à m / z 267. Ce dernier perd le glyoxal en formant l'ion 265e à m / z 209, qui perd une molécule d’hydrogène pour donner l'ion 265m à m / z 207. La molécule protonée peut aussi perdre de l'eau pour donner l'ion 265i à m / z 323, qui élimine du phénylacétylène pour donner l'ion 265j à m / z 221 de structure de bezimidazolone. La molécule protonée 265a peut aussi éliminer successivement de l'eau et le phénylacétylène, pour donner l'ion 265j à m / z 221. Ce dernier donne l'ion 265k à m / z 175 après la perte de l'éthanol.
Enfin, l'ion 265k élimine CO pour donner l'ion 265l à m / z 147. L'ion 265l peut également être produit à partir d'ion 265j par pertes successives de l'éthanol et du CO. Toutes les fragmentations majeures observées pour la 1-éthoxycarbonylméthyl-3-hydroxy -4-
phényltétrahydro-1,5-benzodiazépin-2-one 265 protonée ont concerné le cycle diazépine. De nombreux ions produits ont été formés par différentes voies de dégradation avec élimination concomitante de glyoxal, le benzène et l’acétate d'éthyle, en formant l'ion fragment à m / z 119. Cet ion produit a été observée dans tous les composés étudiés.
3.3.2. Composé 274 (m / z 414) :
A basse énergie CID-MS / MS, l'ion 274a [M+H]+ à m / z 414, générée de la 1,5- benzodiazépine 274, se fragmente pour donner une série d'ions fils (Figure 4).
benzodiazépines
136
Figure 4. Spectre de masse du composé 274
Le spectre de masse met en évidence les principaux ions fragments à m/z 414 (274a), 396 (274h), 356 (274b), 338 (274o), 323 (274f), 278 (274d), 268 (274k), 262 (274p), 259 (274n), 235 (274l), 173 (274e), 160 (274g), 147 (274m), 119 (274c) (tableau 3).
Tableau 3. L’analyse CID-MS / MS à basse-énergie de la 1,5-benzodiazépine 274 mesurée
avec le spectromètre de masse conventionnel QhQ en tandem
Ions Précurseurs choisi [M+H]+
Ions fragments observés
414 (274a) 414 (274a), 396 (274h), 356 (274b), 338 (274o), 323 (274f),
278 (274d), 268 (274k), 262 (274p), 259 (274n), 235 (274l), 173 (274e), 160 (274g), 147 (274m), 119 (274c)
Des voies de fragmentation de la molécule protonée sont décrites dans le schéma 2 et les différentes formations d'ions fragments sont discutées ci-dessous.
benzodiazépines
137
Schéma 2. Les voies de fragmentation proposées en phase gazeuse de la molécule choisie
protonée 274a à m / z 414 observées par le CID-MS / MS.
2 7 4 i 2 7 4 a 2 7 4 b 2 7 4 d 2 7 4 g 2 7 4 n 2 7 4 h 2 7 4 m 2 7 4 c 2 7 4 j 2 7 4 d 2 7 4 f
benzodiazépines
138
L’ion 274a à m / z 414 perd molécule du glyoxal, selon les ruptures des liaisons N-1- C-2 et C-3-C-4 pour donner l'ion produit 274b à m / z 356 de structure benzimidazoline. Ce dernier conduit à l'ion fragment 274c à m / z 119 après élimination successive du benzène et de la méthylidène isoxazoline. L'ion 274b peut également éliminer le benzène pour donner l'ion produit 274d à m / z 278 possédant une structure isoxazolinylmethylbenzimidazole. Ce dernier perd des molécules de benzonitrile et d'hydrogène pour donner l'ion 274e à m / z 173 de structure oxirenylmethylbenzimidazole.
L'ion 274b à m / z 356 peut également éliminer une molécule d’hydroxylamine pour donner l'ion produit 274f à m / z 323. Il faut noter que l'ion produit 274f peut être formé à partir de l'ion 274b' qui est la forme tautomère de 274b. Dans le cas de l'ion 274b', le réarrangement impliqué la migration de l'hydrogène du groupe méthylène lié à l'azote de la benzimidazoline, induisant l'ouverture du noyau isoxazoline, et donnant l’ion intermédiaire 274b''. Ce dernier perd une molécule d’hydroxylamine pour conduire à l'ion 274f (schéma 3).
Schéma 3. Mécanisme proposé pour la formation en phase gazeuse de l'ion fragment 274f à
benzodiazépines
139
Les ions 274d, 274e et 274f discutés, ci-dessus, pourraient également être formés directement à partir de la molécule protonée 274a par élimination du glyoxal suivie de la perte du benzène, de l'hydroxylamine et du benzonitrile.
En outre, la molécule protonée 274a peut éliminer une molécule de la benzodiazépine donnant l'ion produit 274g à m / z 160, tandis que la perte d'eau à partir de 236a donne l’ion produit 274h à m / z 396. Ce dernier ion élimine le phénylacétylène pour donner l'ion produit 274i à m / z 294 ; ce qui donne ultérieurement les ions produits 274j et 274m à m / z 276 et 147 respectivement.
3.3.3. Composé 275 (m / z 448) :
A basse énergie CID-MS / MS, la molécule protonée 275a à m / z 448 donne une série d'ions produits comme indiqué dans la figure 5.
Figure 5. Balayage d'ions produits générés à partir de l’ion 275 à m / z 448.
Le spectre de masse montre les principaux ions produits à m/z 448 (a), 430(h), 390(b), 357(f), 312(d), 302(k), 259(i), 194(g), 173(e), 119(c) (tableau 4).
Tableau 4. L’analyse CID-MS / MS à basse-énergie de la benzodiazépine protonée 275
mesurée avec le spectromètre de masse conventionnel QhQ en tandem
Ion Précurseur choisi [M+H]+
Ions fragments observés
448 (275a) 448 (275a), 430 (275h), 390 (275b), 357 (275f), 312 (275d),
302 (275k), 259 (275i), 194 (275g), 173 (275e), 119 (275c)
D’autre voies de fragmentation de la molécule protonée sont proposées dans le schéma 4 et les formations d'ions produits sont discutées.
benzodiazépines
140
Schéma 4. Voies de fragmentation proposées en phase gazeuse de la molécule protonée 275a
à m / z 448, générées à partir du composé 275
2 7 5 i m /z : 259 2 7 5 b m /z : 390 2 7 5 a m /z : 448 2 7 5 f m /z : 357 2 7 5 d m /z : 312 2 7 5 j m /z : 330 275 g m /z : 194 2 7 5 c m /z : 119 275 g m /z : 194 2 7 5 k m /z : 302 2 7 5 e m /z : 173 275 h m /z : 4 3 0 - C6 H4 Cl -CN
benzodiazépines
141
La molécule protonée de structure 1,5-benzodiazépine 275a peut éliminer une molécule du glyoxal après les ruptures des liaisons N-1-C-2 et C-3-C-4 pour donner l'ion 275b à m / z 390 de structure benzimidazoline. Ce dernier donne l'ion fragment 275c à m / z 119 par l'élimination consécutive du benzène et de la méthylidène isoxazoline. L'ion 275b peut également éliminer le benzène pour donner l'ion 275d à m / z 312 de structure
isoxazolinylmethylbenzimidazole. Ce dernier perd des molécules de benzonitrile et d'hydrogène pour donner l'ion 275e à m / z 173 possédant une structure
oxirenylmethylbenzimidazole.
L'ion 275b à m / z 390 peut également éliminer l'hydroxylamine pour donner l’ion 275f à m / z 357, dont la formation est similaire à celle de 274f indiquée précédemment (schéma 3). Cet ion 275f pourrait également être formé à partir de la molécule protonée 275a par élimination successive du glyoxal et d'hydroxylamine.
La molécule protonée 275a peut également éliminer une molécule benzodiazépine en donnant l'ion produit 275g à m / z 194. La perte d'eau à partir de 275a donne l'ion 275h à m / z 430, qui conduit à l’ion fragment 275i à m / z 259. Un mécanisme pour la formation de l'ion 275i à partir de 275h est proposé dans le Schéma 5.
Schéma 5. Le mécanisme proposé de la formation d'ion fragment 275i à m / z 259 en phase
benzodiazépines
142
L'ion 275a peut subir une rupture des liaisons C-2-C-3 et C-4-N-5, en donnant l'ion produit 275j à m / z 330, qui après la perte d’une molécule d’oxyde de carbone donne l'ion 275k à m / z 302.
La similarité des structures entre les 1,5-benzodiazépines 274 et 275 peut être notée et explique la similitude observée dans leur spectres CID- MS / MS et de leurs voies de
fragmentation. Ainsi, les paires d’ions produits 274c, 275c et 274e, 275e, ne possédant pas d'atome de chlore dans leur structure, ont été identifiées dans le spectre CID-MS / MS des deux composés ; tandis que les ions produits contenant l'atome de chlore ont été observés sans ambiguïté. Ce résultat est très intéressant ; il permet de conclure que les voies de
fragmentation des 1,5-benzodiazépines pourraient être généralisées et servir, ainsi, comme un outil de diagnostic pour la caractérisation structurale systématique des 1,5-benzodiazépines de structures inconnues.
Il convient également de noter que ces ions produits ont été identifiés comme des ions fragments formés au cours d'une seule étape d'ESI-MS QqTOF pour les 1,5-benzodiazépines