A. Caractérisation des RNase III chez M truncatula et d’autres espèces légumineuses.
2. Analyse phylogénétique des protéines DCLs et RTLs
Des analyses phylogénétiques ont été réalisées à partir des séquences protéiques complètes des DCLs et RTLs végétales identifiées ici (Figure 40). Les RNases III de classe I et II d’E. coli et de S. cerevisiae ainsi que les protéines DICER de Candida albicans et d’Homo
sapiens ont été ajoutées à titre de comparaison. Les arbres phylogénétiques ont été
construits dans un premier temps à partir des séquences protéiques complètes, en utilisant le programme Phylogeny (http://phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/index.cgi).
On observe tout d’abord que les protéines RTL4 et RTL5 sont groupées dans un même clade (C1), clairement séparé des autres RNases III (C2 à C7). Les RNases bactériennes et de levures sont ensuite groupées dans un clade frère de celui réunissant la protéine DICER humaine, les DCLs et les protéines RTL1, RTL2 et RTL3 végétales. On peut donc suggérer que ces protéines dériveraient d’une RNase III ancestrale. Dans ce dernier taxon, les protéines DICER/ DCL sont clairement séparées des RTLs.
Pour les DCLs, on observe nettement quatre clades (C4 à C7) correspondant aux 4 protéines d’Arabidopsis et leurs orthologues chez les autres plantes, sachant que les clades des DCL3 et des DCL4 sont les plus proches. Au sein de chaque clade, les distances phylogénétiques entre les protéines sont faibles ce qui illustre leur forte conservation entre organismes. Pour les RTLs (à l’exception des RTL4 et RTL5), 2 clades peuvent être visualisés : un avec toutes les protéines RTL1 (C2) et l’autre avec l’ensemble des protéines RTL2 et la protéine atypique d’A. thaliana, RTL3 (C3). Dans chacun de ces groupes, les protéines de riz sont positionnées sur un noeud situé à leur base, les séparant des protéines des espèces dicotylédones. Enfin, pour les protéines RTL1 de M. truncatula et de pois, on voit que MtRTL1c, MtRTL1d sont groupées et proches de PsRTL1, tandis que MtRTL1a et MtRTL1e sont très proches et groupées avec MtRTL1b.
L’analyse de cet arbre suggère donc un schéma évolutif potentiel des différentes RNases III végétales présenté en Figure 41.
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Figure 40 : Arbre phylogénétique basé sur les séquences protéiques des différentes RNAses III.
L’arbre phylogénétique a été produit à partir des séquences des différentes RNAses III à l’aide de l’outil en ligne phylogeny (http://phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/index.cgi) en suivant la méthode du maximum de vraissemblance. Les séquences correspondant aux DCL1, DCL2, DCL3, DCL4, RTL1, RTL2, RTL3, RTL4 et RTL5 sont respectivement surlignées en rouge, bleu clair, bleu foncé, marron, jaune foncé, jaune clair, vert pâle, vert et violet. Les séquences des RNAses III ne provenant pas de génomes de plantes sont indiquées en orange. Les différents bootstrap en pourcentages sont indiqués en rouge à chaque nœud de l’arbre. Pour les protéines végétales, différents ensembles/clades ont pu être déterminés et notés de 1 à 7 à droite de l’arbre.
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Un autre arbre a été réalisé avec les séquences correspondant aux domaines RIIIDs des RNases III identifiées (Figure 42). Cet arbre diffère à plusieurs niveaux de celui de la
Figure 40. En particulier, les RNases III ne provenant pas d’espèces végétales ne présentent
pas les mêmes positions dans les deux arbres phylogénétiques ce qui remet en cause le schéma proposé en Figure 41. De plus, il fait ressortir clairement une origine évolutive différente entre les deux domaines RIIID des protéines qui en possèdent 2, à savoir les protéines RTL5 et toutes les DCLs. En effet, on observe deux grands clades (RIIID-1 et RIIID2) séparés l’un de l’autre dès le premier nœud de l’arbre phylogénétique. Le clade RIIID-1 regroupe les domaines RIIID uniques des RTL4 et tous les premiers RIIID des protéines à deux domaines. Le clade RIIID-2 est, lui, composé des domaines RIIID des protéines RTL1, RTL2 et RTL3 et des seconds domaines RIIID (plus proches des extrémités C-terminales) des protéines RTL5 et DCLs.
Figure 41 : Modèle évolutif hypothétique des différentes RNAses III de plantes (basé sur les protéines
prédites complètes).
Ce modèle a été élaboré à l’aide de l’arbre phylogénétique réalisé à partir des protéines complètes DICER-LIKE (DCL) et RNAse-THREE-LIKE (RTL) identifiées chez quatre espèces légumineuses, Arabidopsis thaliana et le riz (Figure 40). « High divergence//clade separation » signifie que l’on observe une forte divergence et séparation d’un clade par rapport aux autres avant celle observée pour les RNases III bactériennes et de levures, divergences observées dans l’arbre phylogénétique des RNases III (Figure 40).
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Figure 42 : Arbre phylogénétique basé sur les séquences protéiques des domaines RIIID des RNases III.
L’arbre phylogénétique a été produit à partir des séquences des domaines RNase III (RIIID) des différentes protéines étudiées à l’aide de l’outil en ligne phylogeny (http://phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/index.cgi) en suivant la méthode du maximum de vraissemblance. Lorsqu’une protéine possède deux RIIID, celui situé le plus proche de l’extrémité N- terminale est appelé RIIID-1 et le second, RIIID-2. Les domaines RIIID des protéines DCL1, DCL2, DCL3, DCL4, RTL1, RTL2, RTL3, RTL4 et RTL5 sont respectivement surlignées en rouge, bleu clair, bleu foncé, marron, jaune foncé, jaune clair, vert pâle, vert clair et violet. Les séquences des RNases III ne provenant pas de génome de plantes sont surlignées en orange. Les différents bootstrap en pourcentages sont écrits en rouge à chaque nœud de l’arbre. Différents ensembles/clades ont pu être déterminés, appelés RIIID-1 et RIIID-2.
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Figure 43 : Profils d’expression des gènes MtRTL dans différents organes.
Les profils d’expression ont été obtenus sur la base de données MtGEA v3 disponible sur le site de la Noble Foundation (https://mtgea.noble.org/v3/). MtRTL1a et MtRTL1b sont détectés par la même sonde, Mtr.41531.1.S1_at. Les gènes MtRTL1c, MtRTL2a, MtRTL2b, MtRTL4 et MtRTL5 sont quant à eux respectivement détectés par les sondes Mtr.32052.1.S1_at, Mtr.13056.1.S1_at, Mtr.5735.1.S1_at, Mtr.38971.1.S1_at et Mtr.38473.1.S1_at. Les organes de la partie aérienne (feuille, fleur, tige, graine, etc), les racines et les nodosités (ou racines inoculées par la bactérie symbiotique) sont respectivement surlignées en vert, gris et rose. Les valeurs maximales d’expression sont indiquées à gauche.
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