1. Reverse transcription :
La RT est effectuée avec 2 µg d’ARN total (ARN) en utilisant le kit commercial de synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) (First-Strand cDNA Synthesis Kit ; GE Healthcare). Les ARN sont dénaturés 10 min à 65°C puis ils sont incubés 1 heure à 37°C dans un volume total de réaction de 15 µL contenant 1X Bulk first-strand reaction mix ; 13,33 mM DTT ; 13,33 ng/µL de pd(N)6 primer. Après la réaction, les échantillons d’ADNc, sont dilués au centième dans de l’eau RNAse/ DNAse Free (Gibco) puis ils sont conservés à -20°C.
2. Polymerase Chain Reaction
Pour quantifier le taux d’ADNc d’un gène donné, nous avons utilisé la PCR en temps réel avec la technologie SYBR Green. Le SYBR Green est un composé organique aromatique pouvant se fixer sur tous les types d’acides nucléiques doubles brins. Il permet de quantifier les acides nucléiques en solution car il n’interfère pas avec la réaction de PCR. Il est le principal marqueur utilisé en PCR en temps réel.
Les amorces utilisées pour l’amplification des l’ADNc sont les suivantes : IL-6 de rat (NM_012589) : . sens 5’-TCCTACCCCAACTTCCAATGCTC-3’ . antisens 5’-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3’ Cyclophiline A (NM_017101) : . sens 5’-GAGCACTGGGGAGAAAGGAT-3’ . antisens 5’-CTTGCCATCCAGCCACTCAG-3’ NIS (U60282) : . sens 5’-CGGATCAACCTGATGGACTT-3’ . antisens 5’-AGTTTGGCCTTTCCCTCTGT-3’
La réaction de PCR est préparée avec 5 ng d’ADNc avec le kit LightCycler ® DNA Master SYBR Green I (Roche Applied Science) dans un volume final de 10µL qui contient 1X concentrated reaction mix SYBR Green I dye ; 3 mM MgCl2 ; 0,5 mM d’amorce spécifique pour l’ADNc que l’on veut quantifier. La réaction de PCR est effectuée dans un thermocycleur LightCycler (Roche Applied Science). Cet appareil mesure en temps réel l’incorporation de SYBR Green dans les amplicons à chaque cycle. Ainsi, il calcule un nombre de cycle (Ct) donné ou le seuil de détection du SYBR Green incorporé est atteint. Ainsi, pour calculer le taux ( R ) d’un ADNc donné présent dans un échantillon stimulé par rapport à un échantillon contrôle, on utilise le calcul de ∆ de Ct : R= 2 Ct (contrôle)- Ct (stimulé)
.
On considère que l’efficacité de PCR (E) est ici de 100%, ce qui correspond à 2 copies par cycle. Ainsi, pour chaque réaction de PCR, une gamme-étalon (0,31-10 ng) est effectuée
en interne. Celle-ci permet de calculer E. Pour l’ensemble des réactions de PCR que nous avons réalisées, E était compris entre 89 et 98%.
V. PLASMIDESETAMPLIFICATIONPARTRANSFORMATIONBACTÉRIENNE
Le promoteur humain de l’IL-6, situé en amont du gène rapporteur luciférase et qui contient les nucléotides -1168 à +1 (p1168), a été cloné dans le plasmide pGL3 (pGL3-Basic, Promega Corp., Madison, USA). Le plasmide p1168, le plasmide p1168-mCRE (le site CRE du promoteur de l’IL-6 est muté) et le plasmide p1168-mC/EBP (le site du promoteur de l’IL- 6 qui lie les facteurs de transcription C/EBP est muté) ont été fournis par le Pr G. Haegeman (Gent, Belgium) (Vanden Berghe et coll., 1998). Le plasmide p1168-mNFkB (le site NFkB du promoteur de l’IL-6 est muté) est un don du Dr J. Pierre (INSERM U749). Le plasmide pREP4-ßGal avait été construit au laboratoire. Le plasmide p(NFkB)6-luc qui contient 3 copies d’un oligonucléotide de la région amplificatrice du promoteur du HIV
(5’-ACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGA-3’) est un don du Dr P.A. Baeuerle (Munich, Allemagne). Le plasmide p(CRE)4-luc, qui contient 4 copies d’un oligonucléotide contenant le site CRE (AGCCTGACGTCAGAG) a été commandé chez Stratagene.
La construction du plasmide pGL3-p.IL-6(1168) délété du site AP-1 (p1168-∆AP-1) a été réalisée par mutagénèse dirigée à partir du plasmide pGL3-p.IL-6(1168). La région cible à muter (en minuscules) est :
5'-GACATGCCAAAGTGctgagtcactAATAAAAGAAAAAAAGAAAGTAAAGG-3'.
La suppression du site AP-1 dans le vecteur p1168 a été effectuée par la méthode QuikChange Site-Directed Mutagenesis de Stratagene (La Jolla, CA) en utilisant 1 couple d’amorces :
. sens : 5’-GACATGCCAAAGTGAATAAAAGAAAAAAAGAAAGTAAAGG-3’ . antisens : 5’-CCTTTACTTTCTTTTTTTCTTTTATTCACTTTGGCATGTC-3’
Après digestion des produits d’amplification par l’enzyme de restriction Dpn1, la présence de la mutation de délétion dans le vecteur muté a été vérifiée par PCR en utilisant le couple d’amorce suivant :
. sens : 5’-CAAGACATGCCAAAGTGAAT-3’ . antisens : 5’-GCATACGACGATTCTGTGAT-3’
Pour le primer sens, les 3 nucléotides en 3’ (en gras et soulignés) se trouvent en 3’ de la délétion du site AP-1 alors que les autres nucléotides se trouvent en 5’ de cette délétion.
Après ligation (kit Fast-Link, TEBU) ou non des vecteurs mutés, des bactéries sont transformées (Cf. ci-après). Après amplification bactérienne et purification des plasmides, la présence des vecteurs mutés est détectée par PCR (comme précédemment) ou par analyse des fragments de restriction en utilisant les enzymes Nco1 et Pst1.
Le plasmide p(AP-1) 6x-Luc (p(AP-1)6) a été construit en insérant, par ligation, un oligonucléotide double-brin synthétique, comportant 6 sites consensus AP-1 (TGACTAA) contigus encadrés par un site HinDIII et un site XhoI, en amont d’un gène rapporteur luciférase dans le plasmide pLuc-MCS (Stratagene) linéarisé avec les même enzymes de restriction. L'oligonucléotide double brin a été obtenu en hybridant les deux oligonucléotides suivants par chauffage à 95°C pendant 5min puis en refroidissant jusqu'à 25 °C en 50 min :
. sens :
5’-AGCTGACTAATGACTAATGACTAATGACTAATGACTAA-TGACTAA-3’ . antisens :
5’-TCGATTAGTCATTAGTCATTAGTCATTAGTCATTAGTCATTAGTC-3’
La vérification des plasmides recombinant a été effectué par PCR avec l’oligonucléotide sens et le primer de séquençage pLUC-MCSseq (5’-GCTCTCCAGCGGTTCCATC-3’).
Les plasmides ont été introduits dans des bactéries compétentes E. coli TOP 10 (Invitrogen) par choc thermique. La sélection des colonies transformées a été effectuée sur boites de pétri LB-Agar (Luria-Bertani (SIGMA) : 10 g/l tryptone, 5 g/l d’extrait de levure, 10 g/l de chlorure de sodium, pH 7) contenant 100 µg/mL d’ampicilline (Invitrogen) ; Agar 15g/L (Eurobio). Les colonies transformées ont poussé en suspension à 37°C sous agitation pendant la nuit dans du milieu de LB en présence d’ampicilline. Les suspensions bactériennes centrifugées ont été purifiées avec le kit Endofree Plasmid Maxi (Qiagen). L’ADN élué a été précipité avec 0,7 volumes d’isopropanol et centrifugé à 15 000 g pendant 30 min à 4°C. Les culots d’ADN séchés au dessiccateur ont été repris dans de l’eau. La concentration d’ADN plasmidique purifiée a été mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 260 nm et en utilisant la relation une unité de DO260nm équivaut à une concentration d’ADN de
50 µg/ml.
Toutes les constructions ont été séquencées (MWG-Biotech, Ebersberg, Allemagne) pour vérification.
VI. DOSAGEDESCONCENTRATIONSPROTÉIQUES